scbmtБИОМЕДИЦИНАJournal Biomed2074-59822713-0428Scientific center of biomedical technologies of Federal Medical and Biological Agency10.33647/2713-0428-19-3E-10-24scbmt-1504Research ArticleГЕНЕТИКА И ЭПИГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ-БИОМОДЕЛЕЙGENETICS AND EPIGENETICS OF ANIMALS-BIOMODELSГенетический скрининг новой трансгенной гуманизированной по HLA-A*02:01:01:01 и hβ2m линии мышейGenetic Screening of a New Transgenic Mouse Line Humanized for HLA-A*02:01:01:01 and hβ2mКаркищенкоН. Н.KarkischenkoN. N.

Каркищенко Николай Николаевич - кандидат медицинских наук, профессор, чл.-корр. РАН, акад. РАРАН и Международной академии астронавтики (Париж).

143442, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, 1

Nikolay N. Karkischenko - Dr. Sci. (Med.), Prof., Corr. Member of the RAS, Acad. of the Russian Academy of Rocket and Artillery Sciences, Acad. of the International Academy of Astronautics (Paris).

143442, Moscow Region, Krasnogorsk District, Svetlye Gory Village, 1

niknik2808@yandex.ruГлотоваЕ. С.GlotovaE. S.

Глотова Елена Сергеевна

143442, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, 1

Elena S. Glotova

143442, Moscow Region, Krasnogorsk District, Svetlye Gory Village, 1

savelaine@gmail.comПетроваН. В.PetrovaN. V.

Петрова Наталья Владимировна

143442, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, 1

Nataliya V. Petrova

143442, Moscow Region, Krasnogorsk District, Svetlye Gory Village, 1

m-sklad@yandex.ruСлободенюкВ. В.SlobodenyukV. V.

Cлободенюк Владимир Владимирович - кандидат биологических наук.

143442, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, 1

Vladimir V. Slobodenyuk - Cand. Sci. (Biol.).

143442, Moscow Region, Krasnogorsk District, Svetlye Gory Village, 1

prof-v-iprim@mail.ruЛарюшинаН. А.LaryushinaN. A.

Ларюшина Надежда Андреевна

143442, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, 1

Nadezhda A. Laryushina

143442, Moscow Region, Krasnogorsk District, Svetlye Gory Village, 1

kichi09@mail.ruПетровД. В.PetrovD. V.

Петров Дмитрий Валерьевич

143442, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, 1

Dmitry V. Petrov

143442, Moscow Region, Krasnogorsk District, Svetlye Gory Village, 1

1941-65@mail.ruВасильеваИ. А.Vasil’evaI. A.

Васильева Ирина Андреевна

143442, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, 1

Irina A. Vasil’eva

143442, Moscow Region, Krasnogorsk District, Svetlye Gory Village, 1

rozhstul@mail.ruДерябинК. Е.DeryabinK. E.

Дерябин Кирилл Егорович

143442, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, 1

Kirill E. Deryabin

143442, Moscow Region, Krasnogorsk District, Svetlye Gory Village, 1

sairuswargeartwoguns@gmail.comФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»РоссияScientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of RussiaRussian Federation202319112023193E1024Copyright © Каркищенко Н.Н., Глотова Е.С., Петрова Н.В., Слободенюк В.В., Ларюшина Н.А., Петров Д.В., Васильева И.А., Дерябин К.Е., 20232023Каркищенко Н.Н., Глотова Е.С., Петрова Н.В., Слободенюк В.В., Ларюшина Н.А., Петров Д.В., Васильева И.А., Дерябин К.Е.Karkischenko N.N., Glotova E.S., Petrova N.V., Slobodenyuk V.V., Laryushina N.A., Petrov D.V., Vasil’eva I.A., Deryabin K.E.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.scbmt.ru/jour/article/view/1504

Создание новой гуманизированной трансгенной линии мышей-биомоделей, несущих ген HLA-A*02:01:01:01, требует разработки эффективного метода верификации наличия целевого трансгена в геноме животных. Нами была разработана система генетического скрининга животных на основе метода ПЦР в реальном времени и высокоспецифичных праймеров, позволяющих детектировать все функционально значимые части генетической конструкции. Кроме того, методом секвенирования по Сэнгеру было показано отсутствие химеризма и полное соответствие первичной нуклеотидной последовательности трансгена HLA-A*02:01:01:01 заявленной генно-инженерной конструкции и гену HLA-A*02:01:01:01 человека. По результатам селекционно-генетической работы с полученными трансгенными животными были определены три наиболее перспективные сублинии, которые используются для выведения новой линии гуманизированных трансгенных мышей, несущих ген HLA-A*02:01:01:01.

The development of new humanized transgenic mouse biomodels with the HLA-A*02:01:01:01 gene requires effective methods for target transgene verification in the animal genome. In the present study, we develop a system for genetic screening of animals based on real-time PCR and using highly specific primers to detect all functionally significant parts of the genetic construct. In addition, the Sanger sequencing method showed the absence of chimerism and complete correspondence between the primary nucleotide sequence of the HLA A*02:01:01:01 transgene and the developed engineered genetic construct and human gene HLA A*02:01:01:01. Based on the results of selection and genetic works with the resulting transgenic animals, three most promising sublines were identified. These lines are currently used for breeding a new line of humanized transgenic mice with the HLA-A*02:01:01:01 gene.

ПЦР в реальном временисеквенирование по Сэнгеруверификация трансгенаHLA A*02:01:01:01селекционно-генетическая работаreal-time PCRSanger sequencingtransgene verificationHLA-A*02:01:01:01selection and genetic workработа выполнена в рамках Государственного задания «Создание трансгенных гуманизированных биомоделей с интегрированными генами HLA-А*02:101βt русского человека» (шифр: «Трансгеноз-2021»)the work was carried out within the framework of the State assignment “Creation of transgenic humanized biomodels with integrated <i>HLA-A*02:101 βt</i> genes of the Russian human” (code: “Transgenosis-2021”)ReferencesКаркищенко В.Н., Болотских Л.А., Капанадзе Г.Д., Каркищенко Н.Н., Колоскова Е.М., Максименко С.В., Матвеенко Е.Л., Петрова Н.В., Рябых В.П., Ревякин А.О., Станкова Н.В., Семёнов Х.Х. Создание линий трансгенных животных-моделей с генами человека NAT1 и NAT2. Биомедицина. 2016;1:74–84.Karkischenko V.N., Bolotskih L.A., Kapanadze G.D., Karkischenko N.N., Koloskova E.M., Maksimenko S.V., Matveyenko E.L., Petrova N.V., Ryabyh V.P., Revyakin A.O., Stankova N.V., Semenov H.H. Sozdanie linij transgennyh zhivotnyh-modelejs genami cheloveka NAT1 i NAT2 [Creation of lines of transgenic animal models with human NAT1 and NAT2 genes]. Biomedicina [Journal Biomed]. 2016;1:74–84. (In Russian).Каркищенко В.Н., Рябых В.П., Болотских Л.А., Семенов Х.Х., Капанадзе Г.Д., Петрова Н.В., Езерский В.А., Жукова О.Б., Колоскова Е.М., Максименко С.В., Столярова В.Н., Трубицина Т.П. Физиолого-эмбриологические аспекты создания трансгенных мышей с интегрированными генами NAT1 и NAT2 человека. Биомедицина. 2016;1:52–65.Karkischenko V.N., Ryabyh V.P., Bolotskih L.A., Semenov H.H., Kapanadze G.D., Petrova N.V., Ezerskij V.A., Zhukova O.B., Koloskova E.M., Maksimenko S.V., Stolyarova V.N., Trubicina T.P. Fiziologo-embriologicheskie aspekty sozdaniya transgennyh myshej s integrirovannymi genami NAT1 i NAT2 cheloveka [Physiological and Embryological Aspects of Creation of Transgenic Mice with Integrated Human NAT1 and NAT2 Genes]. Biomedicina [Journal Biomed]. 2016;1:52–65. (In Russian).Каркищенко В.Н., Рябых В.П., Каркищенко Н.Н., Дуля М.С., Езерский В.А., Колоскова Е.М., Лазарев В.Н., Максименко С.В., Петрова Н.В., Столярова В.Н., Трубицина Т.П. Молекулярногенетические аспекты технологии получения трансгенных мышей с интегрированными генами N-ацетилтрансферазы (NAT1 и NAT2) человека. Биомедицина. 2016;1:4–17.Karkischenko V.N., Ryabyh V.P., Karkischenko N.N., Dulya M.S., Ezerskij V.A., Koloskova E.M., Lazarev V.N., Maksimenko S.V., Petrova N.V., Stolyarova V.N., Trubicina T.P. Molekulyarno-geneticheskie aspekty tekhnologii polucheniya transgennyh myshej s integrirovannymi genami N-acetiltransferazy (NAT1 i NAT2) cheloveka [Molecular genetic aspects of the technology for obtaining transgenic mice with integrated human N-acetyltransferase (NAT1 and NAT2) genes]. Biomedicina [Journal Biomed]. 2016;1:4–17. (In Russian).Каркищенко Н.Н., Петрова Н.В., Слободенюк В.В. Высокоспецифичные видовые праймеры к генам Nat1 и Nat2 для сравнительных исследований у человека и лабораторных животных. Биомедицина. 2014;1(2):4–24.Karkischenko N.N., Petrova N.V., Slobodenyuk V.V. Vysokospetsifichnye vidovye prajmery k genam Nat1 i Nat2 dlya sravnitel’nykh issledovanij u cheloveka i laboratornykh zhivotnykh [Highly specific species primers for the Nat1 and Nat2 genes for comparative studies in humans and laboratory animals]. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2014;1(2):4–24. (In Russian].Помыткин И.А., Каркищенко В.Н., Фокин Ю.В., Нестеров М.С., Петрова Н.В. Модель фатального острого поражения легких и острого респираторного дистресс-синдрома. Биомедицина. 2020;16(4):24–33. DOI: 10.33647/2713-0428-16-4-24-33.Pomytkin I.A., Karkischenko V.N., Fokin Yu.V., Nesterov M.S., Petrova N.V. Model’ fatal’nogo ostrogo porazheniya legkikh i ostrogo respiratornogo distress-sindroma [A Model of Fatal Acute Lung Injury and Acute Respiratory Distress Syndrome]. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2020;16(4):24–33. (In Russian). DOI: 10.33647/2713-0428-16-4-24-33.Савченко Е.С., Огнева Н.С., Каркищенко Н.Н. Эмбриологические аспекты создания новой гуманизированной трансгенной линии мышей с интегрированным геном человека HLA-A*02:01:01:01. Биомедицина. 2022;18(4):10–23.Savchenko E.S., Ogneva N.S., Karkischenko N.N. Embriologicheskie aspekty sozdaniya novoj gumanizirovannoj transgennoj linii myshej s integrirovannym genom cheloveka HLAA*02:01:01:01 [Embryological Aspects of Creation a New Humanized Transgenic Mice with Integrated human HLA-A*02:01:01:01 gene]. Biomedicina [Journal Biomed]. 2022;18(4):10–23. (In Russian).Aigner B., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. Journal of molecular medicine. 2010;88:653–664.Aigner B., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. Journal of molecular medicine. 2010;88:653–664.Bai J., Wang J., Yang Y., Wang F., He A., Zhang W. Identification of HLA-A*0201-restricted CTL Epitopes for MLAA-34-specific Immunotherapy for Acute Monocytic Leukemia. J. Immunother. 2021;44(4):141–150.Bai J., Wang J., Yang Y., Wang F., He A., Zhang W. Identification of HLA-A*0201-restricted CTL Epitopes for MLAA-34-specific Immunotherapy for Acute Monocytic Leukemia. J. Immunother. 2021;44(4):141–150.Beckford-Vera D.R., Gonzalez-Junca A., Janneck J.S., Huynh T.L., Blecha J.E., Seo Y., Li X., VanBrocklin H.F., Franc B.L. PET/CT Imaging of Human TNFα Using [89Zr] Certolizumab Pegol in a Transgenic Preclinical Model of Rheumatoid Arthritis. Mol. Imaging Biol. 2020;22(1):105–114.Beckford-Vera D.R., Gonzalez-Junca A., Janneck J.S., Huynh T.L., Blecha J.E., Seo Y., Li X., VanBrocklin H.F., Franc B.L. PET/CT Imaging of Human TNFα Using [89Zr] Certolizumab Pegol in a Transgenic Preclinical Model of Rheumatoid Arthritis. Mol. Imaging Biol. 2020;22(1):105–114.Carter D.B., et al. Phenotyping of transgenic cloned piglets. Cloning and stem cells. 2002;4:131–145.Carter D.B., et al. Phenotyping of transgenic cloned piglets. Cloning and stem cells. 2002;4:131–145.Chen Z., Ruan P., Wang L., Nie X., Ma X., Tan Y. T and B cell Epitope analysis of SARS-CoV-2 S protein based on immunoinformatics and experimental research. J. Cell Mol. Med. 2021.Chen Z., Ruan P., Wang L., Nie X., Ma X., Tan Y. T and B cell Epitope analysis of SARS-CoV-2 S protein based on immunoinformatics and experimental research. J. Cell Mol. Med. 2021.Chu M.L., Moran E. The Limb-Girdle Muscular Dystrophies: Is Treatment on the Horizon? Neurotherapeutics. 2018;15(4):849–862.Chu M.L., Moran E. The Limb-Girdle Muscular Dystrophies: Is Treatment on the Horizon? Neurotherapeutics. 2018;15(4):849–862.Giraldo P., Rival-Gervier S., Houdebine L.M., Montoliu L. The potential benefits of insulators on heterologous constructs in transgenic animals. Transgenic Res. 2003;12:751–755.Giraldo P., Rival-Gervier S., Houdebine L.M., Montoliu L. The potential benefits of insulators on heterologous constructs in transgenic animals. Transgenic Res. 2003;12:751–755.Levedakou E.N., Popko B. Rewiring enervated: thinking LARGEr than myodystrophy. J. Neurosci. Res. 2006;84(2):237–243.Levedakou E.N., Popko B. Rewiring enervated: thinking LARGEr than myodystrophy. J. Neurosci. Res. 2006;84(2):237–243.Ma L., Wang Y., Wang H., Hu Y., Chen J., Tan T., Hu M., Liu X., Zhang R., Xing Y., Zhao Y., Hu X., Li N. Screen and Verification for Transgene Integration Sites in Pigs. Sci. Rep. 2018;8(1):7433.Ma L., Wang Y., Wang H., Hu Y., Chen J., Tan T., Hu M., Liu X., Zhang R., Xing Y., Zhao Y., Hu X., Li N. Screen and Verification for Transgene Integration Sites in Pigs. Sci. Rep. 2018;8(1):7433.Paquet D., Kwart D., Chen A., et al. Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9. Nature. 2016;533:125–129.Paquet D., Kwart D., Chen A., et al. Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9. Nature. 2016;533:125–129.Rogers C.S., et al. Disruption of the CFTR gene produces a model of cystic fibrosis in newborn pigs. Science. 2008;321:1837–1841.Rogers C.S., et al. Disruption of the CFTR gene produces a model of cystic fibrosis in newborn pigs. Science. 2008;321:1837–1841.Russell W.M.S. BRL. The Principles of Humane Experimental Technique. Med. J. Aust. [Internet]. 1960;1(13):500.Russell W.M.S. BRL. The Principles of Humane Experimental Technique. Med. J. Aust. [Internet]. 1960;1(13):500.Schroder A.R.W., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 2002;110:521–529.Schroder A.R.W., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 2002;110:521–529.Thomas R., Shaath H., Naik A., Toor S.M., Elkord E., Decock J. Identification of two HLA-A*0201 immunogenic epitopes of lactate dehydrogenase C (LDHC): potential novel targets for cancer immunotherapy. Cancer Immunol. Immunother. 2020;69(3):449–463.Thomas R., Shaath H., Naik A., Toor S.M., Elkord E., Decock J. Identification of two HLA-A*0201 immunogenic epitopes of lactate dehydrogenase C (LDHC): potential novel targets for cancer immunotherapy. Cancer Immunol. Immunother. 2020;69(3):449–463.Valkenburg S.A., Josephs T.M., Clemens E.B., Grant E.J., Nguyen T.H., Wang G.C., Price D.A., Miller A., Tong S.Y., Thomas P.G., Doherty P.C., Rossjohn J., Gras S., Kedzierska K. Molecular basis for universal HLA-A*0201-restricted CD8+ T-cell immunity against influenza viruses. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2016;113(16):4440–4445.Valkenburg S.A., Josephs T.M., Clemens E.B., Grant E.J., Nguyen T.H., Wang G.C., Price D.A., Miller A., Tong S.Y., Thomas P.G., Doherty P.C., Rossjohn J., Gras S., Kedzierska K. Molecular basis for universal HLA-A*0201-restricted CD8+ T-cell immunity against influenza viruses. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2016;113(16):4440–4445.van Vuuren A.J., van Roon J.A., Walraven V., Stuij I., Harmsen M.C., McLaughlin P.M., van de Winkel J.G., Thepen T. CD64-directed immunotoxin inhibits arthritis in a novel CD64 transgenic rat model. J. Immunol. 2006;176(10):5833–5838.van Vuuren A.J., van Roon J.A., Walraven V., Stuij I., Harmsen M.C., McLaughlin P.M., van de Winkel J.G., Thepen T. CD64-directed immunotoxin inhibits arthritis in a novel CD64 transgenic rat model. J. Immunol. 2006;176(10):5833–5838.Yang D.S., et al. Expression of Huntington’s disease protein results in apoptotic neurons in the brains of cloned transgenic pigs. Hum. Mol. Genet. 2010;19:3983–3994.Yang D.S., et al. Expression of Huntington’s disease protein results in apoptotic neurons in the brains of cloned transgenic pigs. Hum. Mol. Genet. 2010;19:3983–3994.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.