scbmtБИОМЕДИЦИНАJournal Biomed2074-59822713-0428Scientific center of biomedical technologies of Federal Medical and Biological Agency10.33647/2713-0428-19-3E-47-51scbmt-1509Research ArticleМЕТОДЫ И ТЕХНОЛОГИИ БИОМЕДИЦИНСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙMETHODS AND TECHNOLOGIES OF BIOMEDICAL RESEARCHПолучение сверхстабильной метионинаминопептидазы для удаления метионина из рекомбинантных белковObtaining Overstable Methionine Aminopeptidase for the Removal of Methionine From Recombinant ProteinsЛаптеваЮ. С.LaptevaYu. S.

Лаптева Юлия Сергеевна - кандидат биологических наук, Институт биологического приборостроения.

142290, Московская обл., Пущино, просп. Науки, 3

Yulia S. Lapteva - Cand. Sci. (Biol.).

142290, Moscow Region, Pushchino, Nauki Ave., 3

yulia.s.lapteva@gmail.comБыковВ. В.BykovV. V.

Быков Вячеслав Владимирович

142290, Московская обл., Пущино, просп. Науки, 3

Vyacheslav V. Bykov

142290, Moscow Region, Pushchino, Nauki Ave., 3

naggilan88@gmail.comТрунилинаМ. В.TrunilinaM. V.

Трунилина Мария Викторовна

142290, Московская обл., Пущино, просп. Науки, 3

Maria V. Trunilina

142290, Moscow Region, Pushchino, Nauki Ave., 3

masha.trunilina@mail.ruБолдаевскийИ. С.BoldaevskyI. S.

Болдаевский Игорь Сергеевич

142290, Московская обл., Пущино, просп. Науки, 3

Igor S. Boldaevsky

142290, Moscow Region, Pushchino, Nauki Ave., 3

i13boldaevsky@gmail.comКудряшовТ. А.KudryashovT. A.

Кудряшов Тимофей Андреевич

142290, Московская обл., Пущино, просп. Науки, 3

Timofey A. Kudryashov

142290, Moscow Region, Pushchino, Nauki Ave., 3

kudryashovtimm@gmail.comВологжанниковаА. А.VologzhannikovaА. A.

Вологжанникова Алиса Андреевна - кандидат биологических наук.

142290, Московская обл., Пущино, просп. Науки, 3

Alisa A. Vologzhannikova - Cand. Sci. (Biol.).

142290, Moscow Region, Pushchino, Nauki Ave., 3

lisiks.av@gmail.comСоколовА. С.SokolovA. S.

Соколов Андрей Сергеевич - кандидат биологических наук.

142290, Московская обл., Пущино, просп. Науки, 3

Andrey S. Sokolov - Cand. Sci. (Biol.).

142290, Moscow Region, Pushchino, Nauki Ave., 3

212sok@gmail.comИнститут биологического приборостроения ФГБУН ФИЦ «Пущинский научный центр биологических исследований» РАНРоссияInstitute for Biological Instrumentation of the Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of SciencesRussian Federation202320112023193E4751Copyright © Лаптева Ю.С., Быков В.В., Трунилина М.В., Болдаевский И.С., Кудряшов Т.А., Вологжанникова А.А., Соколов А.С., 20232023Лаптева Ю.С., Быков В.В., Трунилина М.В., Болдаевский И.С., Кудряшов Т.А., Вологжанникова А.А., Соколов А.С.Lapteva Y.S., Bykov V.V., Trunilina M.V., Boldaevsky I.S., Kudryashov T.A., Vologzhannikova А.A., Sokolov A.S.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.scbmt.ru/jour/article/view/1509

Отщепление N-концевого инициирующего метионина (Мет1) является критически значимой кои посттрансляционной модификацией, затрагивающей 50–70% клеточных белков. При наработке рекомбинантных белков в гетерологичной системе экспрессии E. сoli отщепление Mет1 часто не происходит, что приводит к гетерогенности получаемых препаратов, изменению их активности и стабильности. Решают эту проблему обработкой рекомбинантных белков in vitro специфическим ферментом — метионинаминопептидазой (МАП). Имеющиеся в настоящее время МАП обладают ограниченными специфичностями и условиями проведения реакций. Нами клонирована МАП из гипертермофильной бактерии, разработана методика очистки фермента, исследован ряд физико-химических свойств. Новый фермент МАП обладает устойчивостью к высоким температурам. МАП сохраняет стабильное нативное состояние в диапазоне рН от 3 до 11 единиц. Новый фермент МАП может быть использования для удаления N-концевого Мет1 из рекомбинантных белков in vitro в широком диапазоне рН и в условиях повышенных температур.

Cleavage of the N-terminal initiating methionine (Met1) is a critical coand post-translational modification affecting 50–70% of cellular proteins. During the production of recombinant proteins in the heterologous system of E. coli expression, Met1 cleavage often fails to occur, which leads to heterogeneity of the preparations obtained, changes in their activity and stability. This problem can be solved by treating recombinant proteins in vitro with a specific enzyme, methionine aminopeptidase (MAP). Currently available MAPs exhibit limited specificities and reaction conditions. We cloned a MAP from a hyperthermophilic bacterium, developed a method for enzyme purification, and studied a number of physicochemical properties. The new MAP enzyme is resistant to elevated temperatures. The MAP maintains a stable native state in a pH range from 3 to 11 units. The novel MAP enzyme can be used to remove N-terminal Met1 from recombinant proteins in vitro over a wide pH range and at elevated temperatures.

метионинаминопептидазаThermus thermophilusгетерологичная экспрессияудаление N-концевого метионинаmethionine aminopeptidaseThermus thermophilusheterologous expressionN-terminal methionine excisionисследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда, грант № 23-24-00563the research was supported by a grant from the Russian Science Foundation, No. 23-24-00563ReferencesAdachi K., et al. Expression of functional soluble human alpha-globin chains of hemoglobin in bacteria. Protein Expr. Purif. 2000;20(1):37–44.Adachi K., et al. Expression of functional soluble human alpha-globin chains of hemoglobin in bacteria. Protein Expr. Purif. 2000;20(1):37–44.Boix E., et al. Role of the N terminus in RNase A homologues: differences in catalytic activity, ribonuclease inhibitor interaction and cytotoxicity. J. Mol. Biol.1996;257(5):992–1007.Boix E., et al. Role of the N terminus in RNase A homologues: differences in catalytic activity, ribonuclease inhibitor interaction and cytotoxicity. J. Mol. Biol.1996;257(5):992–1007.Bradshaw R.A., Brickey W.W., Walker K.W. N-terminal processing: the methionine aminopeptidase and N alpha-acetyl transferase families. Trends Biochem. Sci. 1998;23(7):263–267.Bradshaw R.A., Brickey W.W., Walker K.W. N-terminal processing: the methionine aminopeptidase and N alpha-acetyl transferase families. Trends Biochem. Sci. 1998;23(7):263–267.Chen L., Kashina A. Post-translational Modifications of the Protein Termini. Front. Cell Dev. Biol. 2021;9:719590.Chen L., Kashina A. Post-translational Modifications of the Protein Termini. Front. Cell Dev. Biol. 2021;9:719590.Endo S., et al. The additional methionine residue at the N-terminus of bacterially expressed human interleukin-2 affects the interaction between the Nand C-termini. Biochemistry. 2001;40(4):914–919.Endo S., et al. The additional methionine residue at the N-terminus of bacterially expressed human interleukin-2 affects the interaction between the Nand C-termini. Biochemistry. 2001;40(4):914–919.Giglione C., Boularot A., Meinnel T. Protein N-terminal methionine excision. Cell Mol. Life Sci. 2004;61(12):1455–1474.Giglione C., Boularot A., Meinnel T. Protein N-terminal methionine excision. Cell Mol. Life Sci. 2004;61(12):1455–1474.Giglione C., Vallon O., Meinnel T. Control of protein life-span by N-terminal methionine excision. EMBO J. 2003;22(1):13–23.Giglione C., Vallon O., Meinnel T. Control of protein life-span by N-terminal methionine excision. EMBO J. 2003;22(1):13–23.Liao Y.D., et al. The structural integrity exerted by N-terminal pyroglutamate is crucial for the cytotoxicity of frog ribonuclease from Rana pipiens. Nucleic Acids Res. 2003;31(18):5247–5255.Liao Y.D., et al. The structural integrity exerted by N-terminal pyroglutamate is crucial for the cytotoxicity of frog ribonuclease from Rana pipiens. Nucleic Acids Res. 2003;31(18):5247–5255.Meinnel T., Mechulam Y., Blanquet S. Methionine as translation start signal: a review of the enzymes of the pathway in Escherichia coli. Biochimie. 1993;75(12):1061–1075.Meinnel T., Mechulam Y., Blanquet S. Methionine as translation start signal: a review of the enzymes of the pathway in Escherichia coli. Biochimie. 1993;75(12):1061–1075.Patke S., et al. Characterization of the oligomerization and aggregation of human Serum Amyloid A. PLoS One. 2013;8(6):e64974.Patke S., et al. Characterization of the oligomerization and aggregation of human Serum Amyloid A. PLoS One. 2013;8(6):e64974.Uversky V.N., et al. Structure and stability of recombinant protein depend on the extra N-terminal methionine residue: S6 permutein from direct and fusion expression systems. Biochem. Biophys. Acta. 1999;1432(2):324–332.Uversky V.N., et al. Structure and stability of recombinant protein depend on the extra N-terminal methionine residue: S6 permutein from direct and fusion expression systems. Biochem. Biophys. Acta. 1999;1432(2):324–332.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.