scbmtБИОМЕДИЦИНАJournal Biomed2074-59822713-0428Scientific center of biomedical technologies of Federal Medical and Biological Agency10.33647/2074-5982-20-2-8-20scbmt-1579Research ArticleТРАНСГЕНОЗ И ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ ЖИВОТНЫЕTRANGENOSIS AND HUMANIZED ANIMALSДоказательства трансгенности и гуманизированности у мышей, полученных в НЦБМТ ФМБА России, методом секвенирования по СэнгеруEvidence of Trangency and Humanization in Mice Obtained at the SCBMT of FMBA of Russia by Sanger Sequencing MethodКаркищенкоН. Н.KarkischenkoN. N.

Каркищенко  Николай  Николаевич,  д.м.н., проф., акад.  РАРАН,  чл.-корр.  РАН

143442, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, 1

Nikolay N. Karkischenko, Dr. Sci. (Med.), Prof., Academician  of  the  Russian Academy  of  Rocket and  Artillery  Sciences,  Corresponding  Member of  the  Russian  Academy  of  Sciences

143442, Moscow Region, Krasnogorsk District, Svetlye Gory Village, 1

niknik2808@yandex.ruПетроваН. В.PetrovaN. V.

Петрова  Наталья  Владимировна

143442, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, 1

Nataliya V. Petrova

143442, Moscow Region, Krasnogorsk District, Svetlye Gory Village, 1

m-sklad@yandex.ruСлободенюкВ. В.SlobodenyukV. V.

Слободенюк Владимир Владимирович, к.б.н.

143442, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, 1

Vladimir  V.  Slobodenyuk, Cand.  Sci.  (Biol.)

143442, Moscow Region, Krasnogorsk District, Svetlye Gory Village, 1

prof-v-iprim@mail.ruКолосковаЕ. М.KoloskovaE. M.

Колоскова Елена Михайловна, к.б.н.

249013, Калужская обл., Боровск, п. Институт

Elena M. Koloskova,  Cand. Sci. (Biol.)

249013, Kaluga Region, Borovsk, Institut Village

heleko3@yandex.ruЛарюшинаН. А.LaryushinaN. A.

Ларюшина  Надежда  Андреевна

143442, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, 1

Nadezhda  A.  Laryushina

143442, Moscow Region, Krasnogorsk District, Svetlye Gory Village, 1

kichi09@mail.ruВасильеваИ. А.Vasil’evaI. A.

Васильева Ирина Андреевна

143442, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, 1

Irina A. Vasil’eva

143442, Moscow Region, Krasnogorsk District, Svetlye Gory Village, 1

rozhstul@mail.ruПетровД. В.PetrovD. V.

Петров Дмитрий Валерьевич

143442, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, 1

Dmitriy V. Petrov

143442, Moscow Region, Krasnogorsk District, Svetlye Gory Village, 1

1941-65@mail.ruБолотскихЛ. А.BolotskihL. А.

Болотских Любовь Александровна,  к.с.-х.н.

143442, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, 1

Lyubov’  A.  Bolotskih,  Cand.  Sci.  (Agricult.)

143442, Moscow Region, Krasnogorsk District, Svetlye Gory Village, 1

lyuba.bolotskikh@mail.ruСавинаМ. А.SavinaM. A.

Савина Мария Анатольевна

143442, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, 1

Maria A. Savina

143442, Moscow Region, Krasnogorsk District, Svetlye Gory Village, 1

graff22@mail.ruФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»РоссияScientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of RussiaRussian FederationВсероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания животных — филиал ФГБНУ «Федеральный научный центр животноводства — ВИЖ им. акад. Л.К. Эрнста»РоссияAll-Russian Research Institute of Physiology, Biochemistry and Animal Nutrition — Branch of the Federal Scientific Centre of Animal Husbandry — All-Russian Institute of Animal Husbandry named after Acad. L.K. ErnstRussian Federation202422072024202820Copyright © Каркищенко Н.Н., Петрова Н.В., Слободенюк В.В., Колоскова Е.М., Ларюшина Н.А., Васильева И.А., Петров Д.В., Болотских Л.А., Савина М.А., 20242024Каркищенко Н.Н., Петрова Н.В., Слободенюк В.В., Колоскова Е.М., Ларюшина Н.А., Васильева И.А., Петров Д.В., Болотских Л.А., Савина М.А.Karkischenko N.N., Petrova N.V., Slobodenyuk V.V., Koloskova E.M., Laryushina N.A., Vasil’eva I.A., Petrov D.V., Bolotskih L.А., Savina M.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.scbmt.ru/jour/article/view/1579

В ФГБУН НЦБМТ ФМБА России были созданы несколько гуманизированных трансгенных линий мышей-биомоделей, содержащих интегрированный вариабельный человеческий ген главного комплекса гистосовместимости (МНС): линия HLA-A*02:01, HLA-B*07:02, HLA-C*07:02. Животные получены методом микроинъекций линейного фрагмента генно-инженерной конструкции (ГИК) в мужской пронуклеус зигот с последующим переносом потенциально модифицированных эмбрионов в репродуктивный тракт псевдобеременным самкам-реципиентам. Созданная ГИК кодирует химерную молекулу MHC класса I на поверхности клеток, состоящую из α1-, α2-доменов HLA человека и α3-домена комплекса H-2K мыши, стабилизированную β2-микроглобулином человека, соединённым глицин-сериновым линкером с α1-доменом HLA [1–5]. Данные биомодели могут успешно применяться для решения широкого спектра задач, включая исследования иммунных реакций, инфекционных, аутоиммунных и онкологических заболеваний, а также разработки и тестирования вакцин и исследования в области фармакобезопасности и иммуногенности. В данной статье представлены теоретические данные о генетическом полиморфизме исследуемого гена в человеческом геноме, а также практические данные о созданных нами трансгенных линиях мышей-биомоделей и результаты сравнения аллель-специфичного участка у полученных линий животных. Анализ проводился методом секвенирования по Сэнгеру на матрице кДНК.

Several humanized transgenic lines of biomodel mice containing an integrated variable human gene of the main histocompatibility complex (MHC) have been created at the Federal State Budgetary Scientific and Scientific Research Institute of the FMBA of Russia. These include HLA-A*02:01, HLA-B*07:02 and HLA-C*07:02. The lines were created by microinjection of a linear fragment of a genetically engineered structure (GES) into the male pronucleus of zygotes, followed by the transfer of potentially modified embryos into the reproductive tract to pseudo-pregnant female recipients. The created GES encodes a chimeric molecule of the MHC of class I on the cell surface, consisting of the α1-, α2-domains of human HLA, and the α3-domain of the mouse H-2K complex, stabilized by human β2-microglobulin connected by a glycine serine linker with the α1-domain of HLA [1–5]. The created biomodels can be successfully used to solve a wide range of research tasks, including studies of immune reactions, infectious, autoimmune and oncological diseases, as well as the development and testing of vaccines in the field of pharmacosafety and immunogenicity. This article presents theoretical information on the genetic polymorphism of the studied gene in the human genome, as well as experimental data on the transgenic lines of biomodels created by the authors and the results of comparing the allele-specific site in the obtained animal lines. The analysis was performed by Sanger sequencing on a cDNA matrix.

ПЦР в реальном временитрансгенозHLA-A*02:01HLA -B*07:02HLA -C*07:02гуманизированные трансгенные мышикДНКРНКобратная транскрипциясеквенированиеreal-time PCRtransgenosisHLA-A*02:01HLA-B*07:02HLA-C*07:02humanized transgenic micecDNARNAreverse transcriptionsequencingгосударственное задание по теме «Получение новой линии гуманизированных трансгенных мышей, несущих ген HLA-A*pX человека и нокаут комплекса H-2K мыши» (шифр: «Транснокаут-2024») ФГБУН НЦБМТ ФМБА России.the research topic “Generation of a new line of humanized transgenic mice carrying the human HLA-A*pX gene and knockout of the mouse H-2K complex” (code: “Transknockout-2024”) of state assignment of Scientific Center of Biomedical Technologies of FMBA of Russia.ReferencesКаркищенко В.Н., Петрова Н.В., Савченко Е.С., Огнева Н.С., Колоскова Е.М., Максименко С.В., Манувера В.А., Бобровский П.А., Лазарев В.Н. Создание полных гибридных ДНК-конструкций с геном человека HLA-A*02:01:01:01. Биомедицина. 2021;17(1):10–23.Karkischenko V.N., Petrova N.V., Savchenko E.S., Ogneva N.S., Koloskova E.M., Maksimenko S.V., Manuvera V.A., Bobrovsky P.A., Lazarev V.N. Sozdanie polnih gibritnih DNK konstrukcij s genom cheloveka HLA-A*02:01:01:01 [Chimeric Construct Engineering with Human Variant HLA-A*02:01:01:01]. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2021;17(1):10–23. (In Russian).Каркищенко Н.Н., Лазарев В.Н., Манувера В.А., Бобровский П.А., Петрова Н.В., Колоскова Е.М., Глотова Е.С. Принципы создания генно-инженерной конструкции для получения гуманизированных трансгенных мышей, несущих ген HLA-С*07:02:01:01, как прообраз инновационных трансгенно-нокаутных биомоделей. Биомедицина. 2024;20(1):8–20.Karkischenko N.N., Lazarev V.N., Manuvera V.A., Bobrovsky P.A., Petrova N.V., Koloskova E.M., Glotova E.S. Principles of Creation of a Genetic Engineering Construction for Obtaining Humanized Transgenic Mice with HLA-C*07:02:01:01, as a Promote of Innovative Transgenic and Knockout Biomodels. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2024;20(1):8–20. (In Russian)]. DOI: 10.33647/2074-5982-20-1-8-20.Каркищенко Н.Н., Рябых В.П., Каркищенко В.Н., Колоскова Е.М. Создание гуманизированных мышей для фармакотоксикологических исследований (успехи, неудачи и перспективы). Биомедицина. 2014;1(3):4–22.Karkischenko N.N., Ryabykh V.P., Karkischenko V.N., Koloskova E.M. Sozdanie gumanizirovannykh myshey dlya farmakotoksikologicheskikh issledovaniy (uspekhi, neudachi I perspektivy) [Creation of humanized mice for pharmacotoxicological research (successes, failures and prospects)]. Biomeditsina [ Journal Biomed]. 2014;1(3):4–22. (In Russian)Петрова Н.В., Скрипкина М.М. Особенности организации содержания и выведения трансгенных линий мышей в НЦБМТ ФМБА России. Биомедицина. 2021;17(3E):70–75.Petrova N.V., Skripkina M.M. Osobennosti organizacii soderzhaniya i vyvedeniya transgennyh linij myshej v NCBMT FMBA Rossii [Maintenance and Breeding of Transgenic Mouse Strains at the Scientific Center of Biomedical Technologies of the FMBA of Russia]. Biomeditsina [ Journal Biomed]. 2021;17(3E):70–75. DOI: 10.33647/2713-0428-17-3E-70-75.Савченко Е.С., Огнева Н.С., Каркищенко Н.Н. Эмбриологические аспекты создания новой гуманизированной трансгенной линии мышей с интегрированным геном человека HLA-A*02:01:01:01. Биомедицина. 2022;18(4):10–23.Savchenko E.S., Ogneva N.S., Karkischenko N.N. Embriologicheskie aspekty sozdaniya novoj gumanizirovannoj transgennoj linii myshej s integrirovannym genom cheloveka HLA-A*02:01:01:01 [Embryological aspects of creation a new humanized transgenic mice with integrated human HLA-A*02:01:01:01 gene]. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2022;18(4):10–23. (In Russian)Хамаганова Е.Г., Леонов Е.А., Абдрахимова А.Р., Хижинский С.П., Гапонова Т.В., Савченко В.Г. HLA генетическое разнообразие русской популяции, выявленное методом секвенирования следующего поколения. Медицинская иммунология. 2021;23(3):509–522.Khamaganova E.G., Leonov E.A., Abdrakhimova A.R., Khizhinsky S.P., Gaponova T.V., Savchenko V.G. HLA geneticheskoe raznoobrazie russkoj populyacii, vyyavlennoe metodom sekvenirovaniya sleduyushchego pokoleniya [HLA genetic diversity of the Russian population revealed by next-generation sequencing]. Medical Immunology. 2021;23(3):509–522. DOI: 10.15789/1563-0625-HDI-2182.Giraldo P., Rival-Gervier S., Houdebine L.M., Montoliu L. The potential benefits of insulators on heterologous constructs in transgenic animals. Transgenic Res. 2003;12:751–755.Giraldo P., Rival-Gervier S., Houdebine L.M., Montoliu L. The potential benefits of insulators on heterologous constructs in transgenic animals. Transgenic Res. 2003;12:751–755.Gonzalez-Galarza F.F., McCabe A., et al. Allele frequency net database (AFND) 2020 update: gold-standard data classification, open access genotype data and new query tools. Nucleic Acids Res. 2020;48(D1):D783-D788. DOI: 10.1093/nar/gkz1029.Gonzalez-Galarza F.F., McCabe A., et al. Allele frequency net database (AFND) 2020 update: gold-standard data classification, open access genotype data and new query tools. Nucleic Acids Res. 2020;48(D1):D783-D788. DOI: 10.1093/nar/gkz1029.Goulder P.J.R., Walker B.D. HIV and HLA Class I: an evolving relationship. Immunity. 2012;37(3):426–440. doi: 10.1016/j.immuni.2012.09.005.Goulder P.J.R., Walker B.D. HIV and HLA Class I: an evolving relationship. Immunity. 2012;37(3):426–440. doi: 10.1016/j.immuni.2012.09.005.Lima-Junior J. da C., Pratt-Riccio L.R. Major Histocompatibility Complex and Malaria: Focus on Plasmodium vivax Infection. Front Immunol. 2016;7:13. DOI: 10.3389/fimmu.2016.00013.Lima-Junior J. da C., Pratt-Riccio L.R. Major Histocompatibility Complex and Malaria: Focus on Plasmodium vivax Infection. Front Immunol. 2016;7:13. DOI: 10.3389/fimmu.2016.00013.Ma L., Wang Y., Wang H., Hu Y., Chen J., Tan T., Hu M., Liu X., Zhang R., Xing Y., Zhao Y., Hu X., Li N. Screen and Verification for Transgene Integration Sites in Pigs. Sci. Rep. 2018;8(1):7433.Ma L., Wang Y., Wang H., Hu Y., Chen J., Tan T., Hu M., Liu X., Zhang R., Xing Y., Zhao Y., Hu X., Li N. Screen and Verification for Transgene Integration Sites in Pigs. Sci. Rep. 2018;8(1):7433.Mazzaccaro R.J., Gedde M., Jensen E.R., van Santen H.M., Ploegh H.L., Rock K.L., Bloom B.R. Major histocompatibility class I presentation of soluble antigen facilitated by Mycobacterium tuberculosis infection. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1996;93(21):11786–11791. DOI: 10.1073/pnas.93.21.11786.Mazzaccaro R.J., Gedde M., Jensen E.R., van Santen H.M., Ploegh H.L., Rock K.L., Bloom B.R. Major histocompatibility class I presentation of soluble antigen facilitated by Mycobacterium tuberculosis infection. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1996;93(21):11786–11791. DOI: 10.1073/pnas.93.21.11786.Schroder A.R.W., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 2002;110:521–529.Schroder A.R.W., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 2002;110:521–529.Wang C., Xiong C., Hsu Y.-C., Wang X., Chen L. Human leukocyte antigen (HLA) and cancer immunotherapy: HLA-dependent and -independent adoptive immunotherapies. Annals of Blood. 2020;5:14. DOI: 10.21037/aob-20-27.Wang C., Xiong C., Hsu Y.-C., Wang X., Chen L. Human leukocyte antigen (HLA) and cancer immunotherapy: HLA-dependent and -independent adoptive immunotherapies. Annals of Blood. 2020;5:14. DOI: 10.21037/aob-20-27.Yang D.S., et al. Expression of Huntington’s disease protein results in apoptotic neurons in the brains of cloned transgenic pigs. Hum. Mol. Genet. 2010;19:3983–3994.Yang D.S., et al. Expression of Huntington’s disease protein results in apoptotic neurons in the brains of cloned transgenic pigs. Hum. Mol. Genet. 2010;19:3983–3994.https://hla.alleles.org/nomenclature/naming.htmlhttps://hla.alleles.org/nomenclature/naming.html

The authors declare that there are no conflicts of interest present.