scbmtБИОМЕДИЦИНАJournal Biomed2074-59822713-0428Scientific center of biomedical technologies of Federal Medical and Biological Agency10.33647/2074-5982-20-2-21-31scbmt-1581Research ArticleТРАНСГЕНОЗ И ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ ЖИВОТНЫЕTRANGENOSIS AND HUMANIZED ANIMALSПолучение дифференцированных рекомбинантных белков β2-микроглобулина человека и β2-микроглобулина мыши для его детектирования в химерных молекулах HLA I классаPreparation of Differentiated Recombinant Human β2-Microglobulin and Mouse β2-Microglobulin Proteins for its Detection in Class I HLA Chimeric MoleculesКаркищенкоВ. Н.KarkischenkoV. N.

Каркищенко Владислав Николаевич, д.м.н., проф.,

143442, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, 1

Vladislav N. Karkischenko, Dr. Sci. (Med.), Prof.

143442, Moscow Region, Krasnogorsk District, Svetlye Gory Village, 1

scbmt@yandex.ruЕзерскийВ. А.EzerskiyV. A.

Езерский Вадим Аркадьевич

249013, Калужская обл., Боровск, п. Институт

Vadim A. Ezerskiy

249013, Kaluga Region, Borovsk, Institute Village

ez.vadim@yandex.ruКолосковаЕ. М.KoloskovaE. M.

Колоскова Елена Михайловна, к.б.н.

249013, Калужская обл., Боровск, п. Институт

Elena M. Koloskova, Cand. Sci. (Biol.)

249013, Kaluga Region, Borovsk, Institute Village

heleko3@yandex.ruНестеровМ. С.NesterovM. S.

Нестеров Максим Сергеевич

143442, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, 1

Maxim S. Nesterov

143442, Moscow Region, Krasnogorsk District, Svetlye Gory Village, 1

mdulya@gmail.comФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»РоссияScientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of RussiaRussian FederationВсероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания животных — филиал ФГБНУ «Федеральный научный центр животноводства — ВИЖ им. акад. Л.К. Эрнста»РоссияAll-Russian Research Institute of Physiology, Biochemistry and Animal Nutrition — Branch of the Federal Scientific Centre of Animal Husbandry — All-Russian Institute of Animal Husbandry named after Acad. L.K. ErnstRussian Federation2024230720242022131Copyright © Каркищенко В.Н., Езерский В.А., Колоскова Е.М., Нестеров М.С., 20242024Каркищенко В.Н., Езерский В.А., Колоскова Е.М., Нестеров М.С.Karkischenko V.N., Ezerskiy V.A., Koloskova E.M., Nesterov M.S.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.scbmt.ru/jour/article/view/1581

Трансгенные гуманизированные животные всё более востребованы для биомедицинских исследований, фармакологических испытаний. Создается всё больше линий трансгенных животных, в т.ч. и с нокаутом собственных генов. Остро необходима доказательная база интеграции трансгена, его экспрессии, определение состояния нокаута собственного гена на молекулярно-генетическом уровне, детекция трансляции целевого белка в разных органах и тканях, доказательство отсутствия синтеза белка (или его нефункциональность), ген которого был модифицирован. Для этого требуются высокоспецифичные реагенты — в частности, белки и антитела к ним, в подавляющем большинстве своём представленные иностранными производителями. Была поставлена задача идентификации β2-микроглобулина мыши и человека в белковых фракциях органов и тканей трансгенных и нокаутных мышей нескольких HLA-линий, созданных в последние годы в НЦБМТ ФМБА России. На первом этапе наших исследований были получены штаммы-продуценты E. coli рекомбинантных β2-микроглобулина мыши mβ2mg и β2-микроглобулина hβ2mg человека. Нуклеотидные последовательности генов были адаптированы для синтеза в бактериальной системе, рекомбинантные белки, mβ2mg и hβ2mg очищены и наработаны в количествах, необходимых для получения аффинных сорбентов и иммунизации животных.

Transgenic humanized animals are increasingly in demand for biomedical research and pharmacological testing. More and more lines of transgenic animals are being created, including those with knockout of their own genes. There is an urgent need for an evidence base for the integration of a transgene, its expression, determination of the knockout state of its own gene at the molecular genetic level, detection of translation of the target protein in different organs and tissues, proof for the absence of protein synthesis (or its non-functionality), the gene of which has been modified. This requires highly specific reagents, proteins and antibodies to them in particular, the vast majority of which are presented by foreign manufacturers. The task was set to identify mouse and human β2-microglobulin in protein fractions of organs and tissues of transgenic and knockout mice of several HLA lines created in recent years at the Scientific Center of Biomedical Technologies, Russia. At the first stage of our research, recombinant E. coli producing strains were obtained.

штамм-продуцентрекомбинантный белокβ2-микроглобулин мыши и β2-микроглобулин человекаproducer strainrecombinant proteinmouse β2-microglobulin and human β2-microglobulinгосударственное задание по теме «Получение новой линии гуманизированных трансгенных мышей, несущих ген HLA-A*pX человека и нокаут комплекса H-2K мыши» (шифр: «Транснокаут-2024») ФГБУН НЦБМТ ФМБА России.the research topic “Generation of a new line of humanized transgenic mice carrying the human HLA-A*pX gene and knockout of the mouse H-2K complex” (code: “Transknockout-2024”) of state assignment of Scientific Center of Biomedical Technologies of FMBA of Russia.ReferencesБогомолова T.Г., Добровольская О.А., Мировская А.А., Аль-Шехадат Р.И., Федорова Е.А., Духовлинов И.В., Симбирцев А.С. Разработка кандидатной субстанции рекомбинантного белка CRM197. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2016;15(1):93–98.Bogomolova E.G., Dobrovol'skaya O.A., Mirovskaya A.A., Al-Shehadat R.I., Fedorova E.A., Dukhovlinov I.V., Simbirtsev A.S. Razrabotka kandidatnoj substancii rekombinantnogo belka CRM197 [Development of pharmacology grade substance of recombinant protein CRM197. Epidemiologiya i vaktsinoprofilaktika [ Epidemiology and vaccinal prevention]. 2016;15(1):93–98. DOI: 10.31631/2073-3046-2016-15-1-93-98.Каркищенко Н.Н., Лазарев В.Н., Манувера В.А., Бобровский П.А., Петрова Н.В., Колоскова Е.М., Глотова Е.С. Принципы создания генно-инженерной конструкции для получения гуманизированных трансгенных мышей, несущих ген HLA-С*07:02:01:01, как прообраз инновационных трансгенно-нокаутных биомоделей. Биомедицина. 2024;20(1):8–20.Karkischenko N.N., Lazarev V.N., Manuvera V.A., Bobrovsky P.A., Petrova N.V., Koloskova E.M., Glotova E.S. Principy sozdaniya genno-inzhenernoj konstrukcii dlya polucheniya gumanizirovannyh transgennyh myshej, nesushchih gen HLA-C*07:02:01:01, kak proobraz innovacionnyh transgenno-nokautnyh biomodelej [Principles of Creation of a Genetic Engineering Construction for Obtaining Humanized Transgenic Mice with HLA-C*07:02:01:01, as a Promote of Innovative Transgenic and Knockout Biomodels]. Biomedicina [Journal Biomed]. 2024;20(1):8–20. (In Russian). DOI: 10.33647/2074-5982-20-1-8-20.Каркищенко В.Н., Петрова Н.В., Савченко Е.С., Огнева Н.С., Колоскова Е.М., Максименко С.В., Манувера В.А., Бобровский П.А., Лазарев В.Н. Создание полных гибридных ДНК-конструкций с геном человека HLA-A*02:01:01:01. Биомедицина. 2021;17(1):10–23.Karkischenko V.N., Petrova N.V., Savchenko E.S., Ogneva N.S., Koloskova E.M., Maksimenko S.V., Manuvera V.A., Bobrovsky P.A., Lazarev V.N. Sozdanie polnih gibritnih DNKkonstrukcij s genom cheloveka HLA-A*02:01:01:01 [Chimeric Construct Engineering with Human Variant HLA-A*02:01:01:01]. Biomedicina [ Journal Biomed]. 2021;17(1):10–23. (In Russian). DOI: 10.33647/2074-5982-17-1-10-23.Каркищенко Н.Н., Рябых В.П., Каркищенко В.Н., Колоскова Е.М. Создание гуманизированных мышей для фармакотоксикологических исследований (успехи, неудачи и перспективы). Биомедицина. 2014;1(3):4–22.Karkischenko N.N., Ryabykh V.P., Karkischenko V.N., Koloskova E.M. Sozdanie gumanizirovannykh myshey dlya farmakotoksikologicheskikh issledovaniy (uspekhi, neudachi I perspektivy) [Creation of humanized mice for pharmacotoxicological research (successes, failures and prospects). Biomedicina [ Journal Biomed]. 2014;1(3):4–22. (In Russian)Каркищенко В.Н., Рябых В.П., Каркищенко Н.Н., Дуля М.С., Езерский В.А., Колоскова Е.М., Лазарев В.Н., Максименко С.В., Петрова Н.В., Столярова В.Н., Трубицына Т.П. Молекулярно-генетические аспекты технологии получения трансгенных мышей с интегрированными генами N-ацетилтрансферазы (NAT1 и NAT2) человека. Биомедицина. 2016;1:4–17.Karkischenko V.N., Ryabykh V.P., Karkischenko N.N., Dulya M.S., Ezerskiy V.A., Koloskova E.M., Lazarev V.N., Maksimenko S.V., Petrova N.V., Stolyarova V.N., Trubitsyna T.P. Molekulyarno-geneticheskie aspekty tekhnologii polucheniya transgennykh myshej s integrirovannymi genami N-atsetiltransferazy (NAT1 i NAT2) cheloveka [Molecular and genetic aspects of the technology for producing transgenic mice with integrated genes of human N-acetyltransferase (NAT1 and NAT2)]. Biomedicina [ Journal Biomed]. 2016;1:4–17. (In Russian).Кит О.И., Максимов А.Ю., Протасова Т.П., Гончарова А.С., Кутилин Д.С., Лукбанова Е.А. Гуманизированные мыши: методы получения, модели и использование в экспериментальной онкологии (обзор). Биомедицина. 2019;15(4):67–81.Kit O.I., Maksimov A.Yu., Protasova T.P., Goncharova A.S., Kutilin D.S., Lukbanova E.A. Gumanizirovannye myshi: metody polucheniya, modeli i ispol`zovanie v eksperimental`noj onkologii (obzor) [Humanized Mice: Creation, Models and Use in Experimental Oncology (Review)]. Biomedicina [Journal Biomed]. 2019;15(4):67–81. (In Russian). DOI: 10.33647/2074-5982-15-4-67-81.Петрова Н.В., Скрипкина М.М. Особенности организации содержания и выведения трансгенных линий мышей в НЦБМТ ФМБА России. Биомедицина. 2021;17(3E):70–75.Petrova N.V., Skripkina M.M. Osobennosti organizacii soderzhaniya i vyvedeniya transgennyh linij myshej v NCzBMT FMBA Rossii [Maintenance and Breeding of Transgenic Mouse Strains at the Scientific Center of Biomedical Technologies of the FMBA of Russia]. Biomedicina [Journal Biomed]. 2021;17(3E):70–75. (In Russian). DOI: 10.33647/2713-0428-17-3E-70-75.Савченко Е.С., Огнева Н.С., Каркищенко Н.Н. Эмбриологические аспекты создания новой гуманизированной трансгенной линии мышей с интегрированным геном человека HLA-A*02:01:01:01. Биомедицина. 2022;18(4):10–23.Savchenko E.S., Ogneva N.S., Karkischenko N.N. Embriologicheskie aspekty sozdaniya novoj gumanizirovannoj transgennoj linii myshej s integrirovannym genom cheloveka HLA-A*02:01:01:01 [Embryological Aspects of Creation a New Humanized Transgenic Mice with Integrated Human HLA-A*02:01:01:01 Gene. Biomedicina [ Journal Biomed]. 2022;18(4):10–23. (In Russian). DOI: 10.33647/2074-5982-18-4-10-23.Baneyx F., Mujacic M. Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nat. Biotechnol. 2004;22:1399–1408.Baneyx F., Mujacic M. Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nat. Biotechnol. 2004;22:1399–1408.Borenstein S.H., Graham J., Zhang X.L., Chamberlain J.W. CD8+ T cells are necessary for recognition of allelic, but not locus-mismatched or xeno-, HLA class I transplantation antigens. J. Immunol. 2000;165(5):2341–2353. DOI: 10.4049/jimmunol.165.5.2341.Borenstein S.H., Graham J., Zhang X.L., Chamberlain J.W. CD8+ T cells are necessary for recognition of allelic, but not locus-mismatched or xeno-, HLA class I transplantation antigens. J. Immunol. 2000;165(5):2341–2353. DOI: 10.4049/jimmunol.165.5.2341.Korablev A., Lukyanchikova V., Serova I., Battulin N. On-Target CRISPR/Cas9 Activity Can Cause Undesigned Large Deletion in Mouse Zygotes. Int. J. Mol. Sci. 2020;21:3604. DOI: 10.3390/ijms21103604.Korablev A., Lukyanchikova V., Serova I., Battulin N. On-Target CRISPR/Cas9 Activity Can Cause Undesigned Large Deletion in Mouse Zygotes. Int. J. Mol. Sci. 2020;21:3604. DOI: 10.3390/ijms21103604.Makrides S.C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 1996;60(3):512–538. DOI: 10.1128/mr.60.3.512–538.1996.Makrides S.C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 1996;60(3):512–538. DOI: 10.1128/mr.60.3.512–538.1996.Masemann D., Ludwig S., Boergeling Y. Advances in Transgenic Mouse Models to Study Infections by Human Pathogenic Viruses. Int. J. Mol. Sci. 2020;21(23):9289. DOI: 10.3390/ijms21239289.Masemann D., Ludwig S., Boergeling Y. Advances in Transgenic Mouse Models to Study Infections by Human Pathogenic Viruses. Int. J. Mol. Sci. 2020;21(23):9289. DOI: 10.3390/ijms21239289.Rosano G.L., Ceccarelli E.A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Front Microbiol. 2014;5:172. DOI: 10.3389/fmicb.2014.00172.Rosano G.L., Ceccarelli E.A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Front Microbiol. 2014;5:172. DOI: 10.3389/fmicb.2014.00172.Studier F.W., Moffatt B.A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 1986;189(1):113–130. DOI: 10.1016/0022-2836(86)90385-2.Studier F.W., Moffatt B.A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 1986;189(1):113–130. DOI: 10.1016/0022-2836(86)90385-2.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.