scbmtБИОМЕДИЦИНАJournal Biomed2074-59822713-0428Scientific center of biomedical technologies of Federal Medical and Biological Agency10.33647/2074-5982-20-2-53-65scbmt-1584Research ArticleТРАНСГЕНОЗ И ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ ЖИВОТНЫЕTRANGENOSIS AND HUMANIZED ANIMALSПовышение специфичности поликлональных антител к β2-микроглобулину человека и мыши как альтернатива использованию моноклональных антител в иммунологических методах анализаIncreasing, the Specificity of Polyclonal Antibodies to Human and Mouse β2-Microglobulin as an Alternative to the Use of Monoclonal Antibodies in Immunological AnalysisКаркищенкоН. Н.KarkischenkoN. N.

Каркищенко  Николай  Николаевич,  д.м.н., проф.,  акад.  РАРАН,  чл.-корр.  РАН

143442, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, 1

Nikolay N. Karkischenko, Dr. Sci. (Med.), Prof., Academician  of  the  Russian Academy  of  Rocket and  Artillery  Sciences,  Corresponding  Member of  the  Russian  Academy  of  Sciences

143442, Moscow Region, Krasnogorsk District, Svetlye Gory Village, 1

niknik2808@yandex.ruЕзерскийВ. А.EzerskiyV. A.

Езерский Вадим Аркадьевич

249013, Калужская обл., Боровск, п. Институт

Vadim  A.  Ezerskiy

249013, Kaluga Region, Borovsk, Institut Village

ez.vadim@yandex.ruЖуковаО. Б.ZhukovaO. B.

Жукова  Ольга  Борисовна

249013, Калужская обл., Боровск, п. Институт

Olga B. Zhukova

249013, Kaluga Region, Borovsk, Institut Village

olgazhukova19801031@gmail.comКолосковаЕ. М.KoloskovaE. M.

Колоскова Елена Михайловна, к.б.н.

249013, Калужская обл., Боровск, п. Институт

Elena M. Koloskova, Cand. Sci. (Biol.)

249013, Kaluga Region, Borovsk, Institut Village

heleko3@yandex.ruПетроваН. В.PetrovaN. V.

Петрова  Наталья  Владимировна

143442, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, 1

Nataliya V.  Petrova

143442, Moscow Region, Krasnogorsk District, Svetlye Gory Village, 1

m-sklad@yandex.ruФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»РоссияScientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of RussiaRussian FederationВсероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания животных — филиал ФГБНУ «Федеральный научный центр животноводства — ВИЖ им. акад. Л.К. Эрнста»РоссияAll-Russian Research Institute of Physiology, Biochemistry and Animal Nutrition — Branch of the Federal Scientific Centre of Animal Husbandry — All-Russian Institute of Animal Husbandry named after Acad. L.K. ErnstRussian Federation2024230720242025365Copyright © Каркищенко Н.Н., Езерский В.А., Жукова О.Б., Колоскова Е.М., Петрова Н.В., 20242024Каркищенко Н.Н., Езерский В.А., Жукова О.Б., Колоскова Е.М., Петрова Н.В.Karkischenko N.N., Ezerskiy V.A., Zhukova O.B., Koloskova E.M., Petrova N.V.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.scbmt.ru/jour/article/view/1584

Высокоспецифичные реагенты — белки и антитела к ним — необходимые компоненты систем верификации  эффективности  функционирования  трансгенных/нокаутных  животных  биомоделей. В  частности, идентификация β2-микроглобулина мыши и человека в белковых фракциях органов и тканей трансгенных и нокаутных по гену β2-микроглобулина мышей нескольких HLA-линий, созданных в последние годы в НЦБМТ ФМБА России, является важнейшим этапом их паспортизации. На первом этапе наших исследований были получены штаммы-продуценты E. coli рекомбинантных β2-микроглобулина мыши и человека (mβ2mg и hβ2mg), белки выделены и очищены. На следующем этапе работы получены аффинные сорбенты с иммобилизованными mβ2mg и hβ2mg. Для повышения видовой специфичности сыворотки «кролик-анти-hβ2mg» были истощены против рекомбинантного белка mβ2mg, и, напротив, «кролик-анти-mβ2mg» истощали против рекомбинантного белка hβ2mg. Высокоспецифичные антитела были очищены из истощенных сывороток на аффинных сорбентах. Методами дот- и вестерн-блоттинга на примере истощенных и аффинно-очищенных антител «кролик-анти-hβ2mg» было показано значительное повышение их специфичности относительно hβ2mg.

Highly specific reagents, i.e., proteins and antibodies to them, are the necessary components of systems for verifying the effectiveness of transgenic/knockout animal biomodels. In particular, the identification of   mouse and human β2-microglobulin in the protein fractions of organs and tissues of transgenic and β2m knockout mice of several HLA lines, which have been created in recent years at the Scientific Center of  Biomedical Technologies of the FMBA of Russia, is the most important stage of their certification. At  the first stage of our research,  E. coli  producing strains of recombinant mouse and human β2-microglobulin (mβ2mg and hβ2mg) were obtained, the proteins were isolated and purified. At the next stage of the work, affine sorbents with immobilized mβ2mg and hβ2mg were obtained. To increase the species specificity of the serum, “rabbit-anti-hβ2mg” were depleted against the recombinant protein mβ2mg, and, conversely, “rabbit-anti-mβ2mg” were depleted against the recombinant protein hβ2mg. Highly specific antibodies were purified from depleted sera using affinity sorbents. Using dot- and western-blotting methods оn the example of depleted and affinity-purified rabbit-anti-hβ2mg antibodies, a significant increase in  their specificity relative to hβ2mg was shown.

рекомбинантный белокβ2-микроглобулин мыши и человекаантигенантителаистощение антителиммунизацияrecombinant proteinmouse and human β2-microglobulinantigenantibodiesantibody depletionimmunizationгосударственное задание по теме «Получение новой линии гуманизированных трансгенных мышей, несущих ген HLA-A*pX человека и нокаут комплекса H-2K мыши» (шифр: «Транснокаут-2024») ФГБУН НЦБМТ ФМБА России.the research topic “Generation of a new line of humanized transgenic mice carrying the human HLA-A*pX gene and knockout of the mouse H-2K complex” (code: “Transknockout-2024”) of state assignment of Scientific Center of Biomedical Technologies of FMBA of Russia.ReferencesКаркищенко Н.Н., Рябых В.П., Каркищенко В.Н., Колоскова Е.М. Создание гуманизированных мышей для фармакотоксикологических исследований (успехи, неудачи и перспективы). Биомедицина. 2014;1(3):4–22.Karkischenko N.N., Ryabykh V.P., Karkischenko V.N., Koloskova E.M. Sozdanie gumanizirovannykh myshey dlya farmakotoksikologicheskikh issledovaniy (uspekhi, neudachi I perspektivy) [Creation of humanized mice for pharmacotoxicological research (successes, failures and prospects)]. Biomeditsina [ Journal Biomed]. 2014;1(3):4–22. (In Russian).Каркищенко В.Н., Петрова Н.В., Савченко Е.С., Огнева Н.С., Колоскова Е.М., Максименко С.В., Манувера В.А., Бобровский П.А., Лазарев В.Н. Создание полных гибридных ДНК-конструкций с геном человека HLA-A*02:01:01:01. Биомедицина. 2021;17(1):10–23.Karkischenko V.N., Petrova N.V., Savchenko E.S., Ogneva N.S., Koloskova E.M., Maksimenko S.V., Manuvera V.A., Bobrovsky P.A., Lazarev V.N. Sozdanie polnih gibritnih DNKkonstrukcij s genom cheloveka HLA-A*02:01:01:01 [Chimeric Construct Engineering with Human Variant HLA-A*02:01:01:01]. Biomeditsina [ Journal Biomed]. 2021;17(1):10–23. (In Russian).Каркищенко Н.Н., Лазарев В.Н., Манувера В.А., Бобровский П.А., Петрова Н.В., Колоскова Е.М., Глотова Е.С. Принципы создания генно-инженерной конструкции для получения гуманизированных трансгенных мышей, несущих ген HLA-С*07:02:01:01, как прообраз инновационных трансгенно-нокаутных биомоделей. Биомедицина. 2024;20(1):8–20.Karkischenko N.N., Lazarev V.N., Manuvera V.A., Bobrovsky P.A., Petrova N.V., Koloskova E.M., Glotova E.S. Principy sozdaniya genno-inzhenernoj konstrukcii dlya polucheniya gumanizirovannyh transgennyh myshej, nesushchih gen HLA-S*07:02:01:01, kak proobraz innovacionnyh transgenno-nokautnyh biomodelej [Principles of Creation of a Genetic Engineering Construction for Obtaining Humanized Transgenic Mice with HLA-C*07:02:01:01, as a Promote of Innovative ransgenic and Knockout Biomodels]. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2024;20(1):8–20. (In Russian). doi: 10.33647/2074-5982-20-1-8-20.Петрова Н.В., Скрипкина М.М. Особенности организации содержания и выведения трансгенных линий мышей в НЦБМТ ФМБА России. Биомедицина. 2021;17(3E):70–75.Petrova N.V., Skripkina M.M. Osobennosti organizacii soderzhaniya i vyvedeniya transgennyh linij myshej v NCBMT FMBA Rossii [Maintenance and Breeding of Transgenic Mouse Strains at the Scientific Center of Biomedical Technologies of the FMBA of Russia]. Biomeditsina [ Journal Biomed]. 2021;17(3E):70–75. DOI: 10.33647/2713-0428-17-3E-70-75.Савченко Е.С., Огнева Н.С., Каркищенко Н.Н. Эмбриологические аспекты создания новой гуманизированной трансгенной линии мышей с интегрированным геном человека HLA-A*02:01:01:01.Биомедицина. 2022;18(4):10–23.Savchenko E.S., Ogneva N.S., Karkischenko N.N. Embriologicheskie aspekty sozdaniya novoj gumanizirovannoj transgennoj linii myshej s integrirovannym genom cheloveka HLA-A*02:01:01:01 [Embryological aspects of creation a new humanized transgenic mice with integrated human HLA-A*02:01:01:01 gene]. Biomedicina [Journal Biomed]. 2022;18(4):10–23. (In Russian). DOI: 10.33647/2074-5982-18-4-10-23.Faber E., Tshilwane S.I., Van Kleef M., Pretorius A. The impact of Escherichia coli contamination products present in recombinant African horse sickness virus serotype 4 proteins on the innate and humoral immune responses, Molecular Immunology. 2022:152:1–13. DOI: 10.1016/j.molimm.2022.09.013.Faber E., Tshilwane S.I., Van Kleef M., Pretorius A. The impact of Escherichia coli contamination products present in recombinant African horse sickness virus serotype 4 proteins on the innate and humoral immune responses, Molecular Immunology. 2022:152:1–13. DOI: 10.1016/j.molimm.2022.09.013.Loralyn A.B., Rusung T. Xenogeneic β2-Microglobulin Substitution Affects Functional Binding of MHC Class I Molecules by CD8+ T Cells. J. Immunol. 2007;179(6):3588–3595. DOI: 10.4049/jimmunol.179.6.3588.Loralyn A.B., Rusung T. Xenogeneic β2-Microglobulin Substitution Affects Functional Binding of MHC Class I Molecules by CD8+ T Cells. J. Immunol. 2007;179(6):3588–3595. DOI: 10.4049/jimmunol.179.6.3588.Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation. J. Histochem. Cytochem. 1974;22(12):1084–1091. DOI: 10.1177/22.12.1084.Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation. J. Histochem. Cytochem. 1974;22(12):1084–1091. DOI: 10.1177/22.12.1084.Vaitukaitis J.L. Production of antisera with small doses of immunogen: Multiple intradermal injections. Methodsin Enzymology. 198;73:46–52.Vaitukaitis J.L. Production of antisera with small doses of immunogen: Multiple intradermal injections. Methodsin Enzymology. 198;73:46–52.Williams R.C. Jr., Malone C.C. Antigenic epitopes on beta 2-microglobulin reacting with monoclonal antibodies. J. Lab. Clin. Med. 1993;121(6):805–820.Williams R.C. Jr., Malone C.C. Antigenic epitopes on beta 2-microglobulin reacting with monoclonal antibodies. J. Lab. Clin. Med. 1993;121(6):805–820.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.