scbmtБИОМЕДИЦИНАJournal Biomed2074-59822713-0428Scientific center of biomedical technologies of Federal Medical and Biological Agencyscbmt-16Research ArticleНОВЫЕ БИОМЕДИЦИНСКИЕ ТЕХНОЛОГИИNEW BIOMEDICAL TECHNOLOGIESМолекулярно-генетические аспекты технологии получения трансгенных мышей с интегрированными генами N-ацетилтрансферазы (NAT1 и NAT2) человекаMolecular and genetic aspects of technology of generation transgene mice with the integrated human of Nacetyltransferase genes (NAT1 and NAT2)КаркищенкоВ. Н.KarkischenkoV. N.vlad1672@ya.ruРябыхВ. П.RyabykhV. P.noemail@neicon.ruКаркищенкоН. Н.KarkischenkoN. N.noemail@neicon.ruДуляМ. С.DulyaM. S.noemail@neicon.ruЕзерскийВ. А.EzerskiyV. A.noemail@neicon.ruКолосковаЕ. М.KoloskovaE. M.noemail@neicon.ruЛазаревВ. Н.LazarevV. N.noemail@neicon.ruМаксименкоС. В.MaksimenkoS. V.noemail@neicon.ruПетроваН. В.PetrovaN. V.noemail@neicon.ruСтоляроваВ. Н.StolyarovaV. N.noemail@neicon.ruТрубицинаТ. П.TrubitsinaT. P.noemail@neicon.ruФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»Russian FederationФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания животных»Russian Federation20162502201901417Copyright © Каркищенко В.Н., Рябых В.П., Каркищенко Н.Н., Дуля М.С., Езерский В.А., Колоскова Е.М., Лазарев В.Н., Максименко С.В., Петрова Н.В., Столярова В.Н., Трубицина Т.П., 20192019Каркищенко В.Н., Рябых В.П., Каркищенко Н.Н., Дуля М.С., Езерский В.А., Колоскова Е.М., Лазарев В.Н., Максименко С.В., Петрова Н.В., Столярова В.Н., Трубицина Т.П.Karkischenko V.N., Ryabykh V.P., Karkischenko N.N., Dulya M.S., Ezerskiy V.A., Koloskova E.M., Lazarev V.N., Maksimenko S.V., Petrova N.V., Stolyarova V.N., Trubitsina T.P.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.scbmt.ru/jour/article/view/16

В ходе работы были созданы ДНК-конструкции, включающие нуклеотидные последовательности генов NAT1 и NAT2 человека и промоторно-энхансерную область гена альбумина мыши. Кодирующие части генов NAT1 и NAT2 были амплифицированы с матрицы геномной ДНК человека с использованием олигонуклеотидов NAT1-Not и NAT1-Xho в случае NAT1 и NAT2-Not и NAT2-Xho - в случае NAT2 . Плазмиды pSI-NAT1 и pSI-NAT2 расщепляли эндонуклеазами BamHI и EcoRV (сайт рестрикции EcoRV был введен в олигонуклеотид enAlb-F). Параллельно осуществлялся синтез олигонуклеотидных праймеров и детекция экспрессии генов у людей и создаваемых трансгенных животных с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров. На следующих этапах осуществлялось выделение ДНК/РНК из пробы плазмы крови, амплификация геномной ДНК, идентификация ПЦР-продуктов методом горизонтального электрофореза. Наличие в геле полоски ДНК соответствующего размера свидетельствовало о наличии в образце искомого гена. Получены трансгенные мыши (F0) с интегрированными в их геном конструкциями, включающими нуклеотидные последовательности генов NAT1 и NAT2 человека под промотором гена альбумина мыши. Общая эффективность трансгеноза составила для гена NAT1 - 1,1% и для NAT2 - 0,6%. Анализ интеграции трансгенов в различных органах и тканях у потомков (F1) первичных трансгенных мышей (F0) показал, что встраивание генов NAT1 и NAT2 человека произошло во все три зародышевых листка.

The DNA constructions with nucleotide sequences of human genes of NAT1 and NAT2 and promoter-enhancedregion of a mice albumin gene were created. The coding parts of NAT1 and NAT2 genes were amplified from a matrix of genomic human DNA with use of NAT1-Not and NAT1-Xho oligonucleotides in case of NAT1 and NAT2-Not and NAT2-Xho in case of NAT2 . Plasmids of pSI-NAT1 and pSI-NAT2 split by BamHI and EcoRV endonuclease (the site of a restriction of EcoRV was entered in enAlb-F oligonucleotide). Synthesis of the oligonucleotide primers and detection of human genes expression and the created transgene animals with the use of specific oligonucleotide primers was carried out in parallel. At the following stages allocation of DNA/RNA from blood plasma test, amplification of genomic DNA, identification of PCR products was carried out by method of a horizontal electrophoresis. Existence in gel of DNA strip corresponding size testified to existence in a sample of a required gene. Transgene mice (F0) with the designs integrated into their genome including nucleotide sequences of genes of human NAT1 and NAT2 under the albumin gene mice promoter were generated. Total effectiveness of a transgenesis for NAT1 gene is 1,1% and for NAT2 - 0,6%. The analysis of integration of transgenes in various descendants (F1) organs and tissues of primary transgene mice (F0) showed that human genes NAT1 and NAT2 was found in the cells of all three germinal leaves.

ДНК-конструкции генов NAT1 и NAT2промоторно-энхансерная область генаплазмидывысокоспецифичные праймерыдетекция экспрессии геновамплификациятрансгенозDNA constructions NAT1 and NAT2 genespromoter-enhanced region of geneplasmidshigh-specific primersdetection of a genes expressionamplificationtransgenesisReferencesЕзерский В.А., Тевкин С.И., Трубицина Т.П., Колоскова Е.М., Шишиморова М.С., Безбородова О.А., Якубовская Р.И., Рябых В.П. Интеграция и тканеспецифическая экспрессия гена лактоферрина человека в молочной железе трансгенных кроликов // Проблемы биологии продуктивных животных. 2013. № 4. С. 33-52.Езерский В.А., Тевкин С.И., Трубицина Т.П., Колоскова Е.М., Шишиморова М.С., Безбородова О.А., Якубовская Р.И., Рябых В.П. Интеграция и тканеспецифическая экспрессия гена лактоферрина человека в молочной железе трансгенных кроликов // Проблемы биологии продуктивных животных. 2013. № 4. С. 33-52.Каркищенко Н.Н., Рябых В.П., Каркищенко В.Н., Колоскова Е.М. Создание гуманизированных мышей для фармакотоксилогических исследований (успехи, неудачи и перспективы) // Биомедицина. 2014. № 3. С. 4-22.Каркищенко Н.Н., Рябых В.П., Каркищенко В.Н., Колоскова Е.М. Создание гуманизированных мышей для фармакотоксилогических исследований (успехи, неудачи и перспективы) // Биомедицина. 2014. № 3. С. 4-22.Каркищенко Н.Н., Петрова Н.В., Слободенюк В.В. Высокоспецифичные видовые праймеры к генам NAT1 и NAT2 для сравнительных исследований у человека и лабораторных животных // Биомедицина. 2014. № 2. С. 4- 17.Каркищенко Н.Н., Петрова Н.В., Слободенюк В.В. Высокоспецифичные видовые праймеры к генам NAT1 и NAT2 для сравнительных исследований у человека и лабораторных животных // Биомедицина. 2014. № 2. С. 4- 17.Blin N., Stafford D.W. A general method for isolation of high molecular weight DNA from eukaryotes // Nucleic acids res. 1976. No. 3(9). Pp. 2303-8.Blin N., Stafford D.W. A general method for isolation of high molecular weight DNA from eukaryotes // Nucleic acids res. 1976. No. 3(9). Pp. 2303-8.Boukouvala S., Fakis G. Arylamine N-acetyltransferases: what we learn from genes and genomes // Drug metabolism reviews. 2005. No. 37. Pp. 511-564.Boukouvala S., Fakis G. Arylamine N-acetyltransferases: what we learn from genes and genomes // Drug metabolism reviews. 2005. No. 37. Pp. 511-564.Butcher N.J., Arulpragasam A., Goh H.L., Davey T., Minchin R.F. Human arylamine N-acetyltransferase-1 interacts with EHZF, a multi-functional transcription co-factor // In: Third International Workshop on Arylamine N-acetyltransferases. -Vancouver, Canada. 2004.Butcher N.J., Arulpragasam A., Goh H.L., Davey T., Minchin R.F. Human arylamine N-acetyltransferase-1 interacts with EHZF, a multi-functional transcription co-factor // In: Third International Workshop on Arylamine N-acetyltransferases. -Vancouver, Canada. 2004.Cao W., Chau B., Hunter R., Strnatka D., McQueen C.A., Erickson R.P. Only low levels of exogenous N-acetyltransferase can be achieved in transgenic mice // Pharmacogenetics J. 2005. No. 5. Pp. 255-261.Cao W., Chau B., Hunter R., Strnatka D., McQueen C.A., Erickson R.P. Only low levels of exogenous N-acetyltransferase can be achieved in transgenic mice // Pharmacogenetics J. 2005. No. 5. Pp. 255-261.Cornish V.A., Pinter K., Boukouvala S., Johnson N., Labrousse C., Payton M., Priddle H., Smith A.J., Sim E. Generation and analysis of mice with a targeted disruption of the arylamine N-acetyltransferase type 2 gene // Pharmacogenomics J. 2003. No. 3. Pp. 169-177.Cornish V.A., Pinter K., Boukouvala S., Johnson N., Labrousse C., Payton M., Priddle H., Smith A.J., Sim E. Generation and analysis of mice with a targeted disruption of the arylamine N-acetyltransferase type 2 gene // Pharmacogenomics J. 2003. No. 3. Pp. 169-177.Coughtrie M.W.H., Sharp S., Maxwell K., Innes N.P. Biology and function of the reversible sulfation pathway catalysed by human sulfotransferases and sulfatases // Chem.-biol. interact. 2003. No. 109. Pp. 3-27.Coughtrie M.W.H., Sharp S., Maxwell K., Innes N.P. Biology and function of the reversible sulfation pathway catalysed by human sulfotransferases and sulfatases // Chem.-biol. interact. 2003. No. 109. Pp. 3-27.Erickson R., Morgan C., McQueen C.A. 2nd International NAT Workshop. - Eynsham, Oxford. 2000. Abstract. No. 1.Erickson R., Morgan C., McQueen C.A. 2nd International NAT Workshop. - Eynsham, Oxford. 2000. Abstract. No. 1.Green M.D., Tephly T.R. Glucuronidation of amine substrates by purified and expressed UDP-glucuronosyltransferase proteins // Drug metab. dispos. 1998. No. 26. Pp. 860-867.Green M.D., Tephly T.R. Glucuronidation of amine substrates by purified and expressed UDP-glucuronosyltransferase proteins // Drug metab. dispos. 1998. No. 26. Pp. 860-867.Karolyi J., Erickson R.P., Liu S. Genetics of susceptibility to 6-aminonicotinamide-induced cleft palate in the mouse: studies in congenic and recombinant inbred strains // Teratology. 1988. No. 37. Pp. 283-287.Karolyi J., Erickson R.P., Liu S. Genetics of susceptibility to 6-aminonicotinamide-induced cleft palate in the mouse: studies in congenic and recombinant inbred strains // Teratology. 1988. No. 37. Pp. 283-287.Karolyi J., Erickson R.P., Liu S., Killewald L. Major effects on teratogen-induced facial clefting in mice determined by a single genetic region // Genetics. 1990. No. 126. Pp. 201-205.Karolyi J., Erickson R.P., Liu S., Killewald L. Major effects on teratogen-induced facial clefting in mice determined by a single genetic region // Genetics. 1990. No. 126. Pp. 201-205.Leff M.A., Epstein P.N., Doll M.A., Fretland A.J., Devanaboyina U.S., Rustan T.D., Hein D.W. Prostate-specific human N-acetyltransferase 2 (NAT2) expression in the mouse // J. Pharmacol. exp. ther. 1999. No. 290(1). Pp. 182-187.Leff M.A., Epstein P.N., Doll M.A., Fretland A.J., Devanaboyina U.S., Rustan T.D., Hein D.W. Prostate-specific human N-acetyltransferase 2 (NAT2) expression in the mouse // J. Pharmacol. exp. ther. 1999. No. 290(1). Pp. 182-187.Nebert D.W. Polymorphisms in drug metabolising enzymes: what is their clinical relevance and why do they exist? // Am. J. hum. genet. 1997. No. 60. Pp. 265-271.Nebert D.W. Polymorphisms in drug metabolising enzymes: what is their clinical relevance and why do they exist? // Am. J. hum. genet. 1997. No. 60. Pp. 265-271.Nelson D.R., Koymans L., Kamataki T., Stegeman J.J., Feyereisen R., Waxman D.J., Waterman M.R., Gotoh O., Coon M.J., Estabrook R.W., Gunsalus I.C., Nebert D.W. P450 superfamily: update on new sequences, gene mapping, accession numbers and nomenclature // Pharmacogenetics. 1996. No. 6. Pp. 1-42.Nelson D.R., Koymans L., Kamataki T., Stegeman J.J., Feyereisen R., Waxman D.J., Waterman M.R., Gotoh O., Coon M.J., Estabrook R.W., Gunsalus I.C., Nebert D.W. P450 superfamily: update on new sequences, gene mapping, accession numbers and nomenclature // Pharmacogenetics. 1996. No. 6. Pp. 1-42.Sim E., Pinter K., Mushtaq A., Upton A., Sandy J., Bhakta S., Noble M. Arylamine N-acetyltransferases: a pharmacogenomic approach to drug metabolism and endogenous function // Biochem. soc. trans. 2003. No. 31. Pp. 615-619.Sim E., Pinter K., Mushtaq A., Upton A., Sandy J., Bhakta S., Noble M. Arylamine N-acetyltransferases: a pharmacogenomic approach to drug metabolism and endogenous function // Biochem. soc. trans. 2003. No. 31. Pp. 615-619.Sugamori K.S., Wong S., Brenneman D., Lu X., Grant D.M. NAT3 knockout or over expression in mice has no influence on N-acetylation activity // Drug metab. rev. 2004. No. 36. 164 p.Sugamori K.S., Wong S., Brenneman D., Lu X., Grant D.M. NAT3 knockout or over expression in mice has no influence on N-acetylation activity // Drug metab. rev. 2004. No. 36. 164 p.Sugamori K.S., Wong S., Gaedigk A., Yu V., Abramovici H., Rozmahel R., Grant D.M. Generation and functional characterization of arylamine N-acetyltransferase Nat1/Nat2 double-knockout mice // Mol. pharmacol. 2003. No. 64. Pp. 170-179.Sugamori K.S., Wong S., Gaedigk A., Yu V., Abramovici H., Rozmahel R., Grant D.M. Generation and functional characterization of arylamine N-acetyltransferase Nat1/Nat2 double-knockout mice // Mol. pharmacol. 2003. No. 64. Pp. 170-179.Wong L.-L. Cytochrome P450 monooxygenases // Curr. opin. chem. biol. 1998. No. 2. Pp. 263-268.Wong L.-L. Cytochrome P450 monooxygenases // Curr. opin. chem. biol. 1998. No. 2. Pp. 263-268.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.