scbmtБИОМЕДИЦИНАJournal Biomed2074-59822713-0428Scientific center of biomedical technologies of Federal Medical and Biological Agency10.33647/2074-5982-20-4-8-17scbmt-1668Research ArticleБИОТЕХНОЛОГИИ В БИОМЕДИЦИНЕBIOTECHNOLOGIES IN BIOMEDICINEОценка молекулярных параметров иммуноглобулина антирабического методом высокоэффективной жидкостной хроматографииEvaluation of the Molecular Size Distribution of Rabies Immunoglobulin Using High-Performance Liquid ChromatographyГенераловС. В.GeneralovS. V.

Генералов Сергей Вячеславович, к.б.н.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

Sergey V. Generalov, Cand. Sci. (Biol.)

410005, Saratov, Universitetskaya Str., 46

svgeneraloff@gmail.comСавенковаА. А.SavenkovaA. A.

Савенкова Анастасия Александровна

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

Anastasia A. Savenkova

410005, Saratov, Universitetskaya Str., 46

rusrapi@microbe.ruКиреевМ. Н.KireevM. N.

Киреев Михаил Николаевич, к.м.н.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

Mikhail N. Kireev, Cand. Sci. (Med.)

410005, Saratov, Universitetskaya Str., 46

rusrapi@microbe.ruАбрамоваЕ. Г.AbramovaE. G.

Абрамова Елена Геннадьевна, д.б.н., проф.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46; 410012, Саратов, пр-кт им. Петра Столыпина, 4, стр. 2

Elena G. Abramova, Dr. Sci. (Biol.), Prof.

410005, Saratov, Universitetskaya Str., 46; 410012, Saratov, Petra Stolypina Ave., 4, building 3

rusrapi@microbe.ruШульгинаИ. В.ShulginaI. V.

Шульгина Ирина Витальевна, к.м.н.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

Irina V. Shulgina, Cand. Sci. (Med.)

410005, Saratov, Universitetskaya Str., 46

rusrapi@microbe.ruЛобовиковаО. А.LobovikovaO. A.

Лобовикова Оксана Александровна, к.б.н.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

Oksana A. Lobovikova, Cand. Sci. (Biol.)

410005, Saratov, Universitetskaya Str., 46

rusrapi@microbe.ruФКУН Российский противочумный институт «Микроб» РоспотребнадзораРоссияRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe” of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human WelfareRussian FederationФКУН Российский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора; ФГБОУ ВО «Саратовский государственный университет генетики, биотехнологии и инженерии им. И.Н. Вавилова»РоссияRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe” of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare; Saratov State University of Genetics, Biotechnology and Engineering named after N.I. VavilovRussian Federation202410122024204817Copyright © Генералов С.В., Савенкова А.А., Киреев М.Н., Абрамова Е.Г., Шульгина И.В., Лобовикова О.А., 20242024Генералов С.В., Савенкова А.А., Киреев М.Н., Абрамова Е.Г., Шульгина И.В., Лобовикова О.А.Generalov S.V., Savenkova A.A., Kireev M.N., Abramova E.G., Shulgina I.V., Lobovikova O.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.scbmt.ru/jour/article/view/1668

В Российской Федерации ежегодно риску заражения бешенством подвергается более 400 тыс. человек, в связи с чем антирабический иммуноглобулин является одним из наиболее часто применяемых противовирусных сывороточных препаратов. Для повышения лекарственной безопасности при использовании гетерологичного иммуноглобулина целесообразным является введение показателя качества «молекулярные параметры», отражающего распределение в препарате одиночных молекул иммуноглобулина, их димеров, агрегатов и фрагментов. Исследование содержания указанных фракций в препарате методом высокоэффективной жидкостной хроматографии определяется требованиями XIV издания Государственной Фармакопеи Российской Федерации. Цель работы состояла в определении условий проведения высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения молекулярных параметров гетерологичного антирабического иммуноглобулина. В статье предложена методика определения показателя «молекулярные параметры» с использованием колонки BioSep-SEC-s3000 («Phenomenex Inc.», США) и хроматографической системы Biologic Duoflow («BioRad», США). В качестве объекта исследования использовали производственные образцы антирабического иммуноглобулина из сыворотки крови лошади. При исследовании хроматографических параметров (разрешения между пиками, времени удерживания, симметрии пиков и др.) подобраны условия проведения анализа, удовлетворяющие фармакопейным требованиям. Значения разрешения составили: между пиками мономеров и димеров — 1,42; между пиками агрегатов и мономеров — 3,9; между пиками мономеров и фрагментов — не менее 4,46. Результаты эксперимента показали специфичность и повторяемость методики. Дополнительно показана высокая степень очистки исследуемых коммерческих образцов антирабического иммуноглобулина, которую характеризует отсутствие фракций агрегатов и фрагментов. Полученные результаты позволяют сделать вывод о возможности применения предлагаемой методики с использованием колонки BioSep-SEC-s3000 и хроматографической системы Biologic Duoflow для контроля качества гетерологичного антирабического иммуноглобулина по показателю «молекулярные параметры».

Rabies immunoglobulin is one of the most commonly used antiviral serum drugs. In the Russian Federation, more than 400,000 people are at risk of contracting rabies every year. In order to improve the drug safety when using heterologous immunoglobulin, it is advisable to introduce such a quality indicator as molecular size distribution. This indicator reflects the distribution of single immunoglobulin molecules, their dimers, aggregates, and fragments in the drug. The study of the content of these fractions in the drug using high-performance liquid chromatography is determined by the requirements of the XIV edition of the State Pharmacopoeia of the Russian Federation. The aim of the present study was to establish the conditions for high-performance liquid chromatography when determining the molecular size distribution of heterologous rabies immunoglobulin. A method for determining the indicator of molecular size distribution using a BioSep-SEC-s3000 (“Phenomenex Inc.”, USA) column and a Biologic Duoflow (“BioRad”, USA) chromatographic system is proposed. Commercial and experimental samples of rabies immunoglobulin obtained from horse blood serum were used. When studying chromatographic parameters (resolution between peaks, retention time, peak symmetry, etc.), analysis conditions in accordance with the pharmacopoeial requirements were selected. The resolution values were: between the peaks of monomers and dimers — 1.42; between the peaks of aggregates and monomers – 3.9, between the peaks of monomers and fragments – at least 4.46. The experiment showed the specificity and repeatability of the technique. Additionally, a high degree of purification of the studied commercial samples of rabies immunoglobulin was shown, which is characterized by the absence of fractions of aggregates and fragments. The results obtained allow us to conclude that the proposed method can be used using a BioSep-SEC-s3000 column and a Biologic Duoflow chromatographic system to control the quality of heterologous rabies immunoglobulin in terms of molecular size distribution.

антирабический иммуноглобулинконтроль качествамолекулярные параметрывысокоэффективная жидкостная хроматографияrabies immunoglobulinquality controlmolecular size distributionhigh-performance liquid chromatographyReferencesАбрамова Е.Г., Никифоров А.К., Киреев М.Н., Кочкалова Н.Н., Генералов С.В., Селезнёва А.Г., Савицкая Л.В., Иванов Ю.В. Определение молекулярных параметров препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина методом гельфильтрации. Проблемы особо опасных инфекций. 2010;106(4):54–57. DOI: 10.21055/0370-1069-2010-4(106)-54-57Abramova E.G., Nikiforov A.K., Kireev M.N., Kochkalova N.N., Generalov S.V., Selezneva A.G., Savitskaya L.V., Ivanov Yu.V. Opredelenie molekulyarnykh parametrov preparata geterologichnogo antirabicheskogo immunoglobulina metodom gel'-fil'tratsii [Determination of the molecular parameters of heterologous anti-rabies immunoglobulin using gel-filtration]. Problemy osobo opasnykh infektsiy [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2010;106(4):54–57. (In Russian) DOI: 10.21055/0370-1069-2010-4(106)-54-57Мельников С.А., Борисевич И.В., Рождественский Е.В., Пантюхов В.Б., Черникова Н.К., Гордеев Е.В., Нимирская С.А., Хмелев А.Л., Сыромятникова С.И., Шатохина И.В., Плеханова Т.М., Тиманькова Г.Д., Борисевич С.В., Кутаев Д.А., Стовба Л.Ф., Мишалова Е.Ю. Свойства гетерологичного иммуноглобулина против лихорадки Эбола после длительного хранения. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2020;20(1):50–59. DOI: 10.30895/2221-996X-2020-20-1-50-59Melnikov S.A., Borisevich I.V., Rozhdestvensky E.V., Pantyukhov V.B., Chernikova N.K., Gordeev E.V., Nimirskaya S.A., Khmelev A.L., Syromyatnikova S.I., Shatokhina I.V., Plekhano-va T.M., Timankova G.D., Borisevich S.V., Kutaev D.A., Stovba L.F., Mishalova E.Yu. Svoystva geterologichnogo immunoglobulina protiv likhoradki Ebola posle dlitel'nogo khraneniya [Properties of heterologous anti-ebola immunoglobulin after long storage]. BIOpreparaty. Profilaktika, diagnostika, lechenie [BIOpreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment]. 2020;20(1):50–59. (In Russian) DOI: 10.30895/2221-996X-2020-20-1-50-59Мишалова Е.Ю., Гордеев Е.В., Лебедев В.Н., Мельников С.А., Нимирская С.А., Борисевич С.В. Апробация методики эксклюзионной хроматографии для оценки молекулярных параметров иммуноглобулина против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2019;19(4):261–267. DOI: 10.30895/2221-996X-2019-19-4-261-267Mishalova Е.Yu., Gordeev E.V., Lebedev V.N., Melnikov S.A., Nimirskaya S.A., Borisevich S.V. Aprobatsiya metodiki eksklyuzionnoy khromatografii dlya otsenki molekulyarnykh parametrov immunoglobulina protiv likhoradki Ebola iz syvorotki krovi loshadey [Experimental testing of a size-exclusion chromatography method used for evaluation of molecular parameters of equine anti-Ebola immunoglobulin]. BIOpreparaty. Profilaktika, diagnostika, lechenie [BIOpreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment]. 2019;19(4):261–267. (In Russian) DOI: 10.30895/2221-996X-2019-19-4-261-267Мовсесянц А.А., Бутырский А.Ю., Бондарев В.П., Олефир Ю.В., Постнова Е.Л., Мухачева А.В. К вопросу о применении гетерологичного антирабического иммуноглобулина для специфической профилактики бешенства у людей. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2015;14(5):85–89. DOI: 10.31631/2073-3046-2015-14-5-85-89Movsesyants A.A., Butyrskiy A.Yu., Bondarev V.P., Olefir Yu.V., Postnova E.L., Mukhacheva A.V. Kvoprosu o primenenii geterologichnogo antirabicheskogo immunoglobulina dlya spetsificheskoy profilaktiki beshenstva u lyudey [On the issue of using heterologous antirabies immunoglobulin for specific prophylaxis of rabies in humans]. Epidemiologiya i vaktsinoprofilaktika [Epidemiology and Vaccinal Prevention]. 2015;14(5):85–89. (In Russian) DOI: 10.31631/2073-3046-2015-14-5-85-89Регистр лекарственных средств России.Registr lekarstvennykh sredstv Rossii [Register of Medicines of the Russian Federation]. (In Russian)Репина И.Б., Феклисова Л.В., Скляр Л.Ф., Ушакова А.Ю., Россошанская Н.В., Соловьёва Н.П. Бешенство: обзор литературы и случай из практики. Медицинский оппонент. 2023;3(23):73–80.Repina I.B., Feklisova L.V., Sklyar L.F., Ushakova A.Yu., Rossoshanskaya N.V., Solovyova N.P. Beshenstvo: obzor literatury i sluchay iz praktiki. [Rabies: literature review and case study]. Meditsinskiy opponent [Medical Opponent]. 2023;3(23):73–80. (In Russian).Choi C.W., Jang W., Shim S.B., Song H.J., Cho J., Moon H., Park S.M., Han K., Sohn K.H. Collaborative study for the establishment of national reference standard for molecular size distribution test of human immunoglobulin products. Yahhak HoeJi. 2021;65:223– 227. DOI: 10.17480/psk.2021.65.3.223Choi C.W., Jang W., Shim S.B., Song H.J., Cho J., Moon H., Park S.M., Han K., Sohn K.H. Collaborative study for the establishment of national reference standard for molecular size distribution test of human immunoglobulin products. Yahhak HoeJi. 2021;65:223– 227. DOI: 10.17480/psk.2021.65.3.223Christians S., Schluender S., van Treel N.D., BehrGross M.E. Interpretation of size-exclusion chromatography for the determination of molecular-size distribution of human immunoglobulins. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2016;2016:115–128.Christians S., Schluender S., van Treel N.D., BehrGross M.E. Interpretation of size-exclusion chromatography for the determination of molecular-size distribution of human immunoglobulins. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2016;2016:115–128.Human normal immunoglobulin (intramuscular administration), monograph 0338. Ph. Eur. 11th ed. Strasbourg, France: Council of Europe, 2023.Human normal immunoglobulin (intramuscular administration), monograph 0338. Ph. Eur. 11th ed. Strasbourg, France: Council of Europe, 2023.Jiskoot W., Randolph T.W., Volkin D.B., Middaugh C.R., Schöneich C., Winter G., Friess W., Crommelin D.J., Carpenter J.F. Protein instability and immunogenicity: Roadblocks to clinical application of injectable protein delivery systems for sustained release. J. Pharm. Sci. 2012;101(3):946–954. DOI: 10.1002/jps.23018Jiskoot W., Randolph T.W., Volkin D.B., Middaugh C.R., Schöneich C., Winter G., Friess W., Crommelin D.J., Carpenter J.F. Protein instability and immunogenicity: Roadblocks to clinical application of injectable protein delivery systems for sustained release. J. Pharm. Sci. 2012;101(3):946–954. DOI: 10.1002/jps.23018Lee J.K., Deluccia F.J., Kelly E.L., Davidson C., Borger F.R. Determination of the molecular size distribution of immunoglobulin G (IgG) in intravenous IgG-albumin formulations by high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. 1988;444:141–152. DOI: 10.1016/s0021-9673(01)94017-8Lee J.K., Deluccia F.J., Kelly E.L., Davidson C., Borger F.R. Determination of the molecular size distribution of immunoglobulin G (IgG) in intravenous IgG-albumin formulations by high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. 1988;444:141–152. DOI: 10.1016/s0021-9673(01)94017-8Roberts C.J. Therapeutic protein aggregation: Mechanisms, design, and control. Trends Biotechnol. 2014;32(7):372–380. DOI: 10.1016/j.tibtech.2014.05.005Roberts C.J. Therapeutic protein aggregation: Mechanisms, design, and control. Trends Biotechnol. 2014;32(7):372–380. DOI: 10.1016/j. tibtech.2014.05.005Woznichak M., Vandeberg P., Russ C., Talton Ch., Srivastava J., Arora V., Merritt W.K., Jose M. Application of a caprylate/chromatography purification process for production of a high potency rabies immune globulin from pooled human plasma. J. Immunol. Methods. 2021;499:113–164. DOI: 10.1016/j.jim.2021.113164Woznichak M., Vandeberg P., Russ C., Talton Ch., Srivastava J., Arora V., Merritt W.K., Jose M. Application of a caprylate/chromatography purification process for production of a high potency rabies immune globulin from pooled human plasma. J. Immunol. Methods. 2021;499:113–164. DOI: 10.1016/j.jim.2021.113164Wang H., Levi M.S., Del Grosso A.V., McCormick W.M., Bhattacharyya L. An improved size exclusion-HPLC method for molecular size distribution analysis of immunoglobulin G using sodium perchlorate in the eluent. J. Pharm. Biomed. Anal. 2017;138:330–343. DOI: 10.1016/j.jpba.2017.02.025Wang H., Levi M.S., Del Grosso A.V., McCormick W.M., Bhattacharyya L. An improved size exclusion-HPLC method for molecular size distribution analysis of immunoglobulin G using sodium perchlorate in the eluent. J. Pharm. Biomed. Anal. 2017;138:330–343. DOI: 10.1016/j.jpba.2017.02.025

The authors declare that there are no conflicts of interest present.