scbmtБИОМЕДИЦИНАJournal Biomed2074-59822713-0428Scientific center of biomedical technologies of Federal Medical and Biological Agency10.33647/2074-5982-21-1-18-25scbmt-1696Research ArticleБИОТЕХНОЛОГИИ В БИОМЕДИЦИНЕBIOTECHNOLOGIES IN BIOMEDICINEОптимизация очистки антигенных комплексов Klebsiella pneumoniae методом диафильтрации от гидроксиламинаEffect of Washing Solutions on Diafiltration Efficiency and Properties of Klebsiella pneumoniae Antigenic ComplexesМартыноваД. С.MartynovaD. S.

Мартынова Дарья Сергеевна

105064, Москва, Малый Казенный пер., 5а

Daria S. Martynova

105064, Moscow, Maliy Kazenniy Alleyway, 5а

martynova_d_s@mail.ruСолдатенковаА. В.SoldatenkovaA. V.

Солдатенкова Алена Владимировна, к.б.н.

105064, Москва, Малый Казенный пер., 5а

Alena V. Soldatenkova, Cand. Sci. (Biol.)

105064, Moscow, Maliy Kazenniy Alleyway, 5а

sol.alena.v@yandex.ruКалошинА. А.KaloshinA. A.

Калошин Алексей Алексеевич, к.б.н.

105064, Москва, Малый Казенный пер., 5а

Alexei A. Kaloshin, Cand. Sci. (Biol.)

105064, Moscow, Maliy Kazenniy Alleyway, 5а

alex-k-1973@yandex.ruЛазаревС. А.LazarevS. A.

Лазарев Сергей Александрович

105064, Москва, Малый Казенный пер., 5а

Sergey A. Lazarev

105064, Moscow, Maliy Kazenniy Alleyway, 5а

lazarevsr1@gmail.comАфанасьеваО. М.AfanasyevaO. M.

Афанасьева Ольга Юрьевна

105064, Москва, Малый Казенный пер., 5а

Olga M. Afanasyeva

105064, Moscow, Maliy Kazenniy Alleyway, 5а

kukina1994@mail.ruМихайловаН. А.MikhailovaN. A.

Михайлова Наталья Александровна, д.м.н., проф.

105064, Москва, Малый Казенный пер., 5а

Natalia A. Mikhailova, Dr. Sci. (Med.), Prof.

105064, Moscow, Maliy Kazenniy Alleyway, 5а

n_michailova@inbox.ruФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова»РоссияMechnikov Research Institute of Vaccines and SeraRussian Federation2025210420252111825Copyright © Мартынова Д.С., Солдатенкова А.В., Калошин А.А., Лазарев С.А., Афанасьева О.М., Михайлова Н.А., 20252025Мартынова Д.С., Солдатенкова А.В., Калошин А.А., Лазарев С.А., Афанасьева О.М., Михайлова Н.А.Martynova D.S., Soldatenkova A.V., Kaloshin A.A., Lazarev S.A., Afanasyeva O.M., Mikhailova N.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.scbmt.ru/jour/article/view/1696

Распространенность и антибиотикорезистентность бактерий группы ESKAPE вызывает трудности в их профилактике и лечении. В лаборатории протективных антигенов ФГБНУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» ведется разработка иммуностимулирующих препаратов для профилактики заболеваний, вызываемых некоторыми представителями этой группы, в т. ч. Klebsiella pneumoniae. При выделении протективного антигена в качестве инактивирующего агента в процессе производства препарата используется гидроксиламин, обладающий токсичными для организма человека свойствами. Очистку конечного продукта от него затрудняет полисахаридная капсула, выделяемая K. pneumoniae. Цель работы состояла в оценке эффективности используемых для диафильтрации различных отмывающих растворов и их влияния на специфическую активность и химический состав получаемых антигенных комплексов K. pneumoniae. В исследовании использовали штамм K. pneumoniae 204, выращенный глубинным культивированием. Клетки полученной культуры выделяли методом центрифугирования и инактивировали гидроксиламином. Удаление инактивирующего агента проводили методом ультрафильтрации в режиме диафильтрации с использованием воды или буферов Tris-HCl pH=9,0 различных концентраций. Полученные антигены оценивали по содержанию остаточного гидроксиламина, полисахаридов, белка методом Лоури, нуклеиновых кислот методом Спирина и специфической активности методом РТПГА. Получены образцы антигенсодержащей жидкости K. pneumoniae 204. При использовании в процессе удаления гидроксиламина буферов Tris-HCl pH=9,0 содержание гидроксиламина снижалось до допустимых значений (менее 1 мкг/мл) при использовании 25-кратного объема раствора в любой из исследованных концентраций. Тогда как при использовании дистиллированной воды в качестве очищающего раствора в тех же объемах добиться аналогичного результата не получалось. Проведен анализ химического состава полученных антигенных комплексов. Применение буферного раствора Tris-HCl pH=9,0 10 мМ для удаления гидроксиламина из антигенсодержащей жидкости K. pneumoniae оптимально и не влияет на химический состав и активность ее антигенных комплексов.

The prevalence and antibiotic resistance of ESKAPE bacteria cause difficulties in the prevention and treatment of their infections. Specialists of the Protective Antigen Laboratory of I.I. Mechnikov Scientific Research Institute of Vaccines and Serums continue work on  developing immunostimulating drugs for the prevention of diseases caused by some representatives of this group, including Klebsiella pneumoniae. When producing a drug and isolating a protective antigen, hydroxylamine is used as an inactivating agent. Purification of the final product from this toxic substance is complicated by a polysaccharide capsule secreted by K. pneumoniae. In this work, we evaluate the diafiltration efficiency of various washing solutions and their effect on the specific activity and chemical composition of the resulting antigen complexes of K. pneumoniae. To that end, a submerged cultured strain of K. pneumoniae 204 was used. The cells of the resulting culture were isolated by centrifugation and inactivated with hydroxylamine. The inactivating agent was removed by ultrafiltration in diafiltration mode using water or Tris-HCl buffers (pH=9.0) of  various concentrations. The as-obtained antigens were assessed in terms of the content of residual hydroxylamine, polysaccharides, protein by the Lowry method, nucleic acids by the Spirin method, and specific activity by hemagglutination inhibition assay. Samples of antigen-containing fluid of K. pneumoniae 204 were obtained. The use of Tris-HCl buffers (pH=9.0) for hydroxylamine removal led to a reduction in the hydroxylamine content to acceptable values (less than 1 μg/mL) when using a 25-fold volume of  the solution in any of the studied concentrations. At the same time, the use of distilled water as a purifying solution in  similar volumes did not produce a comparable result. The chemical composition of the resulting antigenic complexes was analyzed. The use of a Tris-HCl buffer solution (pH=9.0) at a concentration of 10 mM proves optimal for removing hydroxylamine from an antigen-containing fluid of K. pneumoniae, having no effect on the chemical composition and activity of its antigen complexes.

K. pneumoniaeкультивированиегидроксиламинультрафильтрациядиафильтрацияK. pneumoniaecultivationhydroxylamineultrafiltrationdiafiltrationнастоящая работа выполнена в рамках соглашения с Министерством промышленности и торговли РФ о предоставлении грантов в форме субсидий из федерального бюджета бюджетным учреждениям на реализацию проектов по разработке лекарственных препаратов и медицинских изделий № 020-15-2021-005 от 07.10.2021.The work was carried out within the framework of the agreement with the Ministry of Industry and Trade of the Russian Federation on the provision of grants in the form of subsidies from the Federal budget to budgetary institutions for the implementation of projects on the development of drugs and medi cal devices No. 020-15-2021-005 dated 10/07/2021.ReferencesМУК 4.1/4.2.588-96 «Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям».MUK 4.1/4.2.588-96 «Metody kontrolya medicinskih immunobiologicheskih preparatov, vvod imyh lyudyam» [Guidelines 4.1/4.2.588-96 “Methods for control of medical immunobiological preparations administered to humans”. (In Russian).ОФС.1.7.2.0008.15 «Определение концентрации клеток микроорганизмов».General Pharmacopoeia Article 1.7.2.0008.15 “Determination of the concentration of microorganism cells”]. (In Russian).ОФС.1.7.2.0018.15 Определение нуклеиновых кис лот по методу Спирина в биологических лекарственных препаратах.OFS.1.7.2.0018.15 Opredelenie nukleinovyh kislot po metodu Spirina v biologicheskih lekarstvennyh preparatah [General Pharmacopoeia Article 1.7.2.0018.15 Determination of Nucleic Acids by Spirin's Method in Biological Medicinal Products]. (In Russian).ОФС.1.2.3.0019.15 Определение сахаров спектрофотометрическим методом.General Pharmacopoeia Article 1.2.3.0019.15 Determination of Sugars by Spectrophotometric Method]. (In Russian).Cakmakci M.L., Evans H.J., Seidler R.J. Characte ristics of nitrogen-fixing Klebsiella oxytoca isolat ed from wheat roots. Plant soil. 1981;61(1):53–63. DOI: 10.1007/BF02277362.Cakmakci M.L., Evans H.J., Seidler R.J. Characte ristics of nitrogen-fixing Klebsiella oxytoca isolat ed from wheat roots. Plant soil. 1981;61(1):53–63. DOI: 10.1007/BF02277362.Gorrie C.L., Mirceta M., Wick R.R., Edwards D.J., Thomson N.R., Strugnell R.A., et al. Gastrointestinal Carriage Is a Major Reservoir of Klebsiella pneumo niae Infection in Intensive Care Patients. Clin. Infect. Dis. 2017;65(2):208–215.Gorrie C.L., Mirceta M., Wick R.R., Edwards D.J., Thomson N.R., Strugnell R.A., et al. Gastrointestinal Carriage Is a Major Reservoir of Klebsiella pneumo niae Infection in Intensive Care Patients. Clin. Infect. Dis. 2017;65(2):208–215.Huang M., Lin L., Wu Y., Honhing H., He P., Li G., He P., et al. Pathogenicity of Klebsiella pneumonia (KpC4) infecting maize and mice. J. Integr. Agric. 2016;15(7):1510–1520. DOI: 3119(16)61334-5. 10.1016/S2095Huang M., Lin L., Wu Y., Honhing H., He P., Li G., He P., et al. Pathogenicity of Klebsiella pneumonia (KpC4) infecting maize and mice. J. Integr. Agric. 2016;15(7):1510–1520. DOI: 3119(16)61334-5. 10.1016/S2095Kumar P., Dash B., Suyal D.C., Gupta S.B., Singh A.K., Chowdhury T., et al. Characterization of Arsenic-Resistant Klebsiella pneumoniae RnASA11 from Contaminated Soil and Water Samples and Its Bioremediation Potential. Curr. Microbiol. 2021;78(8):3258–3267. DOI: 10.1007/s00284-02102602-w.Kumar P., Dash B., Suyal D.C., Gupta S.B., Singh A.K., Chowdhury T., et al. Characterization of Arsenic-Resistant Klebsiella pneumoniae RnASA11 from Contaminated Soil and Water Samples and Its Bioremediation Potential. Curr. Microbiol. 2021;78(8):3258–3267. DOI: 10.1007/s00284-02102602-w.Li B., Zhao Y., Liu C., Chen Z., Zhou D. Molecular patho genesis of Klebsiella pneumoniae. Future Microbiol. 2014;9(9):1071–1081. DOI: 10.2217/fmb.14.48.Li B., Zhao Y., Liu C., Chen Z., Zhou D. Molecular patho genesis of Klebsiella pneumoniae. Future Microbiol. 2014;9(9):1071–1081. DOI: 10.2217/fmb.14.48.Marques C., Menezes J., Belas A., Aboim C., Cavaco Silva P., Trigueiro G., et al. Klebsiella pneumoniae causing urinary tract infections in companion animals and humans: population structure, antimicrobial resis tance and virulence genes. J. Antimicrob. Chemother. 2019;74(3):594–602. DOI: 10.1093/jac/dky499.Marques C., Menezes J., Belas A., Aboim C., Cavaco Silva P., Trigueiro G., et al. Klebsiella pneumoniae causing urinary tract infections in companion animals and humans: population structure, antimicrobial resis tance and virulence genes. J. Antimicrob. Chemother. 2019;74(3):594–602. DOI: 10.1093/jac/dky499.Pendleton J.N., Gorman S.P., Gilmore B.F. Clinical relevance of the ESKAPE pathogens. Expert Rev. Anti Infect. Ther. 2013;11(3):297–308. DOI: 10.1586/eri.13.12.Pendleton J.N., Gorman S.P., Gilmore B.F. Clinical relevance of the ESKAPE pathogens. Expert Rev. Anti Infect. Ther. 2013;11(3):297–308. DOI: 10.1586/eri.13.12.Pereira S.G., Alarico S., Tiago I., Reis D., Nunes Costa D., Cardoso O., et al. Studies of antimicrobi al resistance in rare mycobacteria from a nosoco mial environment. BMC Microbiol. 2019;19(1):62. DOI: 10.1186/s12866-019-1428-4.Pereira S.G., Alarico S., Tiago I., Reis D., Nunes Costa D., Cardoso O., et al. Studies of antimicrobi al resistance in rare mycobacteria from a nosoco mial environment. BMC Microbiol. 2019;19(1):62. DOI: 10.1186/s12866-019-1428-4.Rendueles O. Deciphering the role of the capsule of Klebsiella pneumoniae during pathogenesis: A cau tionary tale. Mol. Microbiol. 2020;113(5):883–888. DOI: 10.1111/mmi.14474.Rendueles O. Deciphering the role of the capsule of Klebsiella pneumoniae during pathogenesis: A cau tionary tale. Mol. Microbiol. 2020;113(5):883–888. DOI: 10.1111/mmi.14474.Wyres K.L., Holt K.E. Klebsiella pneumoniae as a key trafficker of drug resistance genes from to clinically important bacteria. Curr. Opin. Microbiol. 2018;45:131–139. DOI: 10.1016/j.mib.2018.04.004.Wyres K.L., Holt K.E. Klebsiella pneumoniae as a key trafficker of drug resistance genes from to clinically important bacteria. Curr. Opin. Microbiol. 2018;45:131–139. DOI: 10.1016/j.mib.2018.04.004.Zadoks R.N., Griffiths H.M., Munoz M.A., Ahlstrom C., Bennett G.J., Thomas E., et al. Sources of Klebsiella and Raoultella species on dairy farms: be careful where you walk. J. Dairy Sci. 2011;94(2):1045–1051. DOI: 10.3168/jds.2010-3603.environmentalZadoks R.N., Griffiths H.M., Munoz M.A., Ahlstrom C., Bennett G.J., Thomas E., et al. Sources of Klebsiella and Raoultella species on dairy farms: be careful where you walk. J. Dairy Sci. 2011;94(2):1045–1051. DOI: 10.3168/jds.2010-3603.environmental

The authors declare that there are no conflicts of interest present.