scbmtБИОМЕДИЦИНАJournal Biomed2074-59822713-0428Scientific center of biomedical technologies of Federal Medical and Biological Agency10.33647/2074-5982-21-3-12-24scbmt-1749Research ArticleГЕНЕТИКА И ЭПИГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ-БИОМОДЕЛЕЙGENETICS AND EPIGENETICS OF ANIMALS-BIOMODELSРеалии создания гуманизированных трансгенных персонифицированных животных для биомедицинских исследований: переход от плазмидного варианта к рибонуклеопротеиновому комплексу CRISPR/Cas9Realities in the Creation of Humanized Transgenic Personalized Animals for Biomedical Research: Transition from Plasmid to CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein ComplexКаркищенкоН. Н.KarkischenkoN. N.

Каркищенко Николай Николаевич - акад. РАРАН, чл.-корр. РАН, д.м.н., проф.

143442, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, 1

Nikolay N. Karkischenko - Academician of the Russian Academy of Rocket and Artillery Sciences, Corresponding Member of the Russian Academy of Sciences, Dr. Sci. (Med.), Prof.

143442, Moscow Region, Krasnogorsk District, Svetlye gory Village, 1

niknik2808@yandex.ruКолосковаЕ. М.KoloskovaE. M.

Колоскова Елена Михайловна - к.б.н..

249013, Калужская обл., Боровск, п. Институт

Elena M. Koloskova - Cand. Sci. (Biol.).

Kaluga Region, Borovsk, Institut Village

heleko3@yandex.ruПетроваН. В.PetrovaN. V.

Петрова Наталья Владимировна

143442, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, 1

Natalia V. Petrova

143442, Moscow Region, Krasnogorsk District, Svetlye gory Village, 1

m-sklad@yandex.ruФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»РоссияScientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of RussiaRussian FederationВсероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания животных — филиал ФГБНУ «Федеральный научный центр животноводства — ВИЖ им. акад. Л.К. Эрнста»РоссияAll-Russian Research Institute of Physiology, Biochemistry and Animal Nutrition — Branch of the Federal Scientific Center of Animal Husbandry — The All-Russian Institute of Animal Husbandry named after Academician L.K. ErnstRussian Federation2025191020252131224Copyright © Каркищенко Н.Н., Колоскова Е.М., Петрова Н.В., 20252025Каркищенко Н.Н., Колоскова Е.М., Петрова Н.В.Karkischenko N.N., Koloskova E.M., Petrova N.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.scbmt.ru/jour/article/view/1749

Одно из основных направлений деятельности НЦБМТ ФМБА России — создание гуманизированных генно-модифицированных животных для научных и биомедицинских исследований. С использованием классического трансгенеза и плазмидного варианта CRISPR/Cas9-технологии начиная с 2013 года в Центре было получено более 20 линий трансгенных, нокаутных и трансгеннонокаутных животных — мышей-биомоделей. Основными «специализированными» линиями являются гуманизированные трансгенные мыши-биомодели, несущие аллели HLA класса I — HLA-В*, HLA-В**, HLA-В***, HLA-С*, HLA-B*07:02, HLA-С*07:02, HLA-A*02:01, HLA-В*** КО, HLAA** КО, HLA-B**** КО, HLA-С** КО, а также NAT1, NAT2, АСЕ2 hom, hACE2-Tom (HDR-KI), SMN2 (S2), PrPSc, АСЕ2 hom / HLA-C**, β2m мыши KO, PrP КО, STE24 КО, SMN (S6) КО, SMN2 КО, PrP КО / PrPSc, NAT1 KO, NAT2 KO.

В статье анализируются генетические конструкции и методы, с помощью которых получены генномодифицированные животные. Обобщен многолетний опыт применения плазмидного варианта и рассматривается необходимость перехода к рибонуклеопротеиновому комплексу CRISPR/Cas9: высокая эффективность и специфичность, высокая частота целевых модификаций; возможность использования нескольких гРНК; встраивание одной копии HDR-ДНК-матрицы (трансген). Рассматривается возможность замещения импортных реактивов и наборов реагентами отечественного производства.

Creation of humanized genetically modified animals for biomedical research is an important direction in the activity of the Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency (FMBA) of Russia. Since 2013, the Center has obtained more than 20 lines of transgenic, knockout, and transgenically-knockout mouse biomodels using classical transgenesis and the plasmid version of the CRISPR/Cas9 technology. The main specialized lines involve humanized transgenic mouse biomodels carrying alleles HLA class I — HLA-В*, HLA-В**, HLA-В***, HLA-С*, HLA-B*07:02, HLA-С*07:02, HLA-A*02:01, HLA-В*** КО, HLA-A** КО, HLA-B**** КО, HLA-С** КО, as well as NAT1, NAT2, АСЕ2 hom, hACE2-Tom (HDRKI), SMN2 (S2), PrPSc, АСЕ2 hom / HLA-C**, β2m mus KO, PrP КО, STE24 КО, SMN (S6) КО, SMN2 КО, PrP КО / PrPSc, NAT1 KO, NAT2 KO. In this article, we review the genetic constructs and methods used to produce genetically modified animals. The article summarizes the long-term experience of using the plasmid variant and discusses the need to switch to the CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complex in the view of its high efficiency and specificity, high frequency of targeted modifications, the ability to use multiple gRNAs, and the insertion of a single copy of the HDR-DNA template (transgene). We also explore the possibility of replacing imported reagents and kits with domestic products.

трансгенезCRISPR/Cas9нокаут генарX330гРНКрибонуклеопротеиновый комплексHLA class Iлинии мышейtransgenesisCRISPR/Cas9gene knockoutpX330ribonucleoprotein complexgRNAHLA class Imouse linesгосударственное задание по теме «Получение новой линии гуманизированных трансгенных мышей, несущих ген HLA-A*pX человека и нокаут комплекса H-2K мыши» (шифр: «Транснокаут-2024») ФГБУН НЦБМТ ФМБА Россииthe research was supported by the topic “Generation of a new line of humanized transgenic mice carrying the human HLA-A*pX gene and knockout of the mouse H-2K complex” (code: “Transknockout-2024”) of state assignment of Scientific Center of Biomedical Technologies of FMBA of RussiaReferencesКаркищенко Н.Н., Рябых В.П., Каркищенко В.Н., Колоскова Е.М. Создание гуманизированных мышей для фармакотоксикологических исследований (успехи, неудачи и перспективы). Биомедицина. 2014;1(3):4–22.Karkischenko N.N., Ryabykh V.P., Karkischenko V.N., Koloskova E.M. Sozdanie gumanizirovannykh myshey dlya farmakotoksikologicheskikh issledovaniy (uspekhi, neudachi I perspektivy) [Creation of humanized mice for pharmacotoxicological research (successes, failures and prospects)]. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2014;1(3):4–22. (In Russian).Каркищенко В.Н., Рябых В.П., Каркищенко Н.Н., Дуля М.С., Езерский В.А., Колоскова Е.М. Лазарев В.Н., Максименко С.В., Петрова Н.В., Столярова В.Н., Трубицына Т.П. Молекулярногенетические аспекты технологии получения трансгенных мышей с интегрированными генами N-ацетилтрансферазы (NAT1 и NAT2) человека. Биомедицина. 2016;1:4–17.Karkischenko V.N., Ryabykh V.P., Karkischenko N.N., Dulya M.S., Ezerskiy V.A., Koloskova E.M., Lazarev V.N., Maksimenko S.V., Petrova N.V., Stolyarova V.N., Trubitsyna T.P. Molekulyarno-geneticheskie aspekty tekhnologii polucheniya transgennykh myshej s integrirovannymi genami N-atsetiltransferazy (NAT1 i NAT2) cheloveka [Molecular and genetic aspects of the technology for producing transgenic mice with integrated genes of human N-acetyltransferase (NAT1 and NAT2)]. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2016;1:4–17. (In Russian).Каркищенко В.Н., Болотских Л.А., Капанадзе Г.Д., Каркищенко Н.Н., Колоскова Е.М., Максименко С.В., Матвеенко Е.Л., Петрова Н.В., Рябых В.П., Ревякин А.О., Станкова Н.В., Семенов Х.Х. Создание линий трансгенных животных-моделей с генами человека NAT1 и NAT2. Биомедицина. 2016;1:74–84.Karkischenko V.N., Bolotskikh L.A., Kapanadze G.D., Karkischenko N.N., Koloskova E.M., Maksimenko S.V., Matveyenko E.L., Petrova N.V., Ryabykh V.P., Revyakin A.O., Stankova N.V., Semenov Kh. Kh. Sozdaniye liniy transgennykh zhivotnykh-modeley s genami cheloveka NAT1 i NAT2 [Creation of lines of transgenic animal models with human genes NAT1 and NAT2]. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2016;1:74–84. (In Russian).Каркищенко В.Н., Берзина А.Г., Петрова Н.В., Помыткин И.А., Глотова Е.С., Петров Д.В., Табоякова Л.А., Болотских Л.А., Ларюшина Н.А. Доказательство наличия целевых белков — β2m hom и HLA у гуманизированных трансгенных мышей линий HLA-A*02:01, HLA-B*07:02 и HLA-C*07:02. Биомедицина. 2024;20(2):32–44. DOI: 10.33647/2074-5982-20-2-32-44Karkischenko V.N., Berzina A.G., Petrova N.V., Pomytkin I.A., Glotova E.S., Petrov D.V., Taboyakova L.A., Bolotskih L.A., Laryushina N.А. Dokazatel'stvo nalichiya celevyh belkov — β2m hom i HLA u gumanizirovannyh transgennyh myshej linij HLA-A*02:01, HLA-B*07:02 i HLA-C*07:02 [Evidence for the Presence of β2m hom Target Proteins and HLA in Humanized Transgenic Mice of HLA-A*02:01, HLA-B*07:02, and HLA-C*07:02 Lines]. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2024;20(2):32–44. (In Russian). DOI: 10.33647/2074-5982-20-2-32-44Каркищенко Н.Н., Лазарев В.Н., Манувера В.А., Бобровский П.А., Петрова Н.В., Колоскова Е.М., Глотова Е.С. Принципы создания генно-инженерной конструкции для получения гуманизированных трансгенных мышей, несущих ген HLA-С*07:02:01:01, как прообраз инновационных трансгенно-нокаутных биомоделей. Биомедицина. 2024;20(1):8–20. DOI: 10.33647/2074-5982-20-1-8-20.Karkischenko N.N., Lazarev V.N., Manuvera V.A., Bobrovsky P.A., Petrova N.V., Koloskova E.M., Glotova E.S. Principy sozdaniya genno-inzhenernoj konstrukcii dlya polucheniya gumanizirovannyh transgennyh myshej, nesushchih gen HLA-C*07:02:01:01, kak proobraz innovacionnyh transgenno-nokautnyh biomodelej [Principles of Creation of a Genetic Engineering Construction for Obtaining Humanized Transgenic Mice with HLA-C*07:02:01:01, as a Promote of Innovative Transgenic and Knockout Biomodels]. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2024;20(1):8–20. (In Russian). DOI: 10.33647/2074-5982-20-1-8-20.Каркищенко В.Н., Петрова Н.В., Савченко Е.С., Огнева Н.С., Колоскова Е.М., Максименко С.В., Манувера В.А., Бобровский П.А., Лазарев В.Н. Создание полных гибридных ДНК-конструкций с геном человека HLA-A*02:01:01:01. Биомедицина. 2021;17(1):10–23. DOI: 10.33647/2074-5982-17-1-10-23.Karkischenko V.N., Petrova N.V., Savchenko E.S., Ogneva N.S., Koloskova E.M., Maksimenko S.V., Manuvera V.A., Bobrovsky P.A., Lazarev V.N. Sozdanie polnih gibridnih DNK konstrukcij s genom cheloveka HLA-A*02:01:01:01 DOI: 10.33647/2713-0428-19-3E-10-24.Каркищенко Н.Н., Глотова Е.С., Петрова Н.В., Слободенюк В.В., Ларюшина Н.А., Петров Д.В., Васильева И.А., Дерябин К.Е. Генетический скрининг новой трансгенной гуманизированной по HLA-A*02:01:01:01 и hβ2m линии мышей. Биомедицина. 2023;19(3E):10–24. DOI: 10.33647/2713-0428-19-3E-10-24.Karkischenko N.N., Glotova E.S., Petrova N.V., Slobodenyuk V.V., Laryushina N.A., Petrov D.V., Vasil’eva I.A., Deryabin K.E. Geneticheskij skrining novoj transgennoj gumanizirovannoj po HLA-A*02:01:01:01 i hβ2m linii myshej [Genetic Screening of a New Transgenic Mouse Line Humanized for HLA-A*02:01:01:01 and hβ2m]. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2023;19(3E):10–24. (In Russian). DOI: 10.33647/2713-0428-19-3E-10-24.Савченко Е.С., Огнева Н.С., Каркищенко Н.Н. Эмбриологические аспекты создания новой гуманизированной трансгенной линии мышей с интегрированным геном человека HLA-A*02:01:01:01. Биомедицина. 2022;18(4):10–23. DOI: 10.33647/2074-5982-18-4-10-23.Savchenko E.S., Ogneva N.S., Karkischenko N.N. Embriologicheskie aspekty sozdaniya novoj gumanizirovannoj transgennoj linii myshej s integrirovannym genom cheloveka HLA-A*02:01:01:01 Embryological Aspects of Creating a New Humanized Transgenic Mouse Line with an Integrated Human Gene HLA-A*02:01:01:01]. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2022;18(4):10–23. (In Russian). DOI: 10.33647/2074-5982-18-4-10-23.Chang H., Pannunzio N.R., Adachi N., Lieber M.R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2017;18(8):495–506. DOI: 10.1038/nrm.2017.48.Chang H., Pannunzio N.R., Adachi N., Lieber M.R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2017;18(8):495–506. DOI: 10.1038/nrm.2017.48.Concordet J.P., Haeussler M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Res. 2018;46(W1):W242–W245. DOI: 10.1093/nar/gky354.Concordet J.P., Haeussler M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Res. 2018;46(W1):W242–W245. DOI: 10.1093/nar/gky354.Cong L., Ran F.A., Cox D., Lin S., Barretto R., Habib N., Hsu P.D., Wu X., Jiang W., Marraffini L.A., Zhang F. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013;339(6121):819–823. DOI: 10.1126/science.1231143.Cong L., Ran F.A., Cox D., Lin S., Barretto R., Habib N., Hsu P.D., Wu X., Jiang W., Marraffini L.A., Zhang F. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013;339(6121):819–823. DOI: 10.1126/science.1231143.Heyer W.D., Ehmsen K.T., Liu J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annu. Rev. Genet. 2010;44:113–139. DOI: 10.1146/annurev-genet-051710-150955.Heyer W.D., Ehmsen K.T., Liu J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annu. Rev. Genet. 2010;44:113–139. DOI: 10.1146/annurev-genet-051710-150955.Hsu P.D., Scott D.A., Weinstein J.A., Ran F.A., Konermann S., Agarwala V., Li Y., Fine E.J., Wu X., Shalem O., Cradick T.J., Marraffini L.A., Bao G., Zhang F. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. 2013;31(9):827–832. DOI: 10.1038/nbt.2647.Hsu P.D., Scott D.A., Weinstein J.A., Ran F.A., Konermann S., Agarwala V., Li Y., Fine E.J., Wu X., Shalem O., Cradick T.J., Marraffini L.A., Bao G., Zhang F. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. 2013;31(9):827–832. DOI: 10.1038/nbt.2647.Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337(6096):816–821.Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337(6096):816–821.Mashiko D., Fujihara Y., Satouh Y., Miyata H., Isotani A., Ikawa M. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Sci. Rep. 2013;3:3355. DOI: 10.1038/srep03355Mashiko D., Fujihara Y., Satouh Y., Miyata H., Isotani A., Ikawa M. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Sci. Rep. 2013;3:3355. DOI: 10.1038/srep03355Montague T.G., Cruz J.M., Gagnon J.A., Church G.M., Valen E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 2014;42(Web Server issue):W401–W407. DOI: 10.1093/nar/gku410Montague T.G., Cruz J.M., Gagnon J.A., Church G.M., Valen E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 2014;42(Web Server issue):W401–W407. DOI: 10.1093/nar/gku410Symington L.S., Gautier J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annu. Rev. Genet. 2011;45:247–271. DOI: 10.1146/annurev-genet-110410-132435.Symington L.S., Gautier J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annu. Rev. Genet. 2011;45:247–271. DOI: 10.1146/annurev-genet-110410-132435.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.