Динамика стабильности экспрессии генов sdha, hprt, prl3d1 и hes1 в рамках моделирования фиброза печени крыс

До настоящего времени не удалось выявить универсального набора референсных генов для нормализации данных полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Многочисленные исследования, затрагивающие выбор референсных генов для конкретных целей, далеко не всегда тщательно прорабатывают стратегию выбора. В ряде работ этап выбора референсных генов в принципе не используется ввиду дороговизны и иных причин. В результате этого для нормализации данных часто используются гены, неплохо зарекомендовавшие себя в иных, часто отличающихся, обстоятельствах эксперимента. Цель настоящего исследования заключалась в изучении динамики уровня мРНК генов в рамках моделирования фиброза печени крыс тиоацетамидом.
При рассмотрении процесса фиброгенеза в целом, от интактной печени до развитого в ней фиброза, оптимальными референсными генами являются hes1 и sdha. Однако при акцентах на конкретных этапах фиброза стоит выбирать пару генов в зависимости от показателей стабильности. На начальных стадиях фиброгенеза можно использовать sdha и hprt. Ген hes1 наилучшим образом подойдёт на роль референсного в том случае, когда среднее значение Cq генов-мишеней будет составлять примерно 29 циклов (как у hes1). С осторожностью стоит использовать hes1 при работе в диапазонах Cq генов-мишеней 26–29 и более 30, поскольку ошибка в таком случае будет нарастать. В отношение гена sdha, придерживаясь того же принципа, отметим как оптимум значение Cq, равное 27. В то же время допустима работа с диапазоном Cq 24–27, а в диапазонах выше 28 использование sdha может быть сопряжено с повышением ошибок расчётов.

1. Birerdinc A., Mehta R., Alhussain R., Afendi A., Chandhoke V., Younossi Z., Баранова А. Выбор надёжных контрольных генов для количественной ПЦР в реальном времени на образцах неопухолевой ткани желудка человека. Молекулярная биология. 2012;46(1):166–175.

2. Bai Y., Chen H., Yuan Z.W., Wang W. Normal and abnormal embryonic development of the anorectum in rats. J. Pediatr. Surg. 2004;39(4):587–590. DOI: 10.1016/j.jpedsurg.2003.12.002.

3. Bustin S., Nolan T. Talking the talk, but not walking the walk: RT-qPCR as a paradigm for the lack of reproducibility in molecular research. Eur. J. Clin. Invest. 2017;47(10):756–774. DOI: 10.1111/eci.12801.

4. Bustin S.A., Benes V., Garson J.A., Hellemans J., Huggett J., Kubista M., Mueller R., Nolan T., Pfaffl M.W., Shipley G.L., Vandesompele J., Wittwer C.T. The MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin. Chem. 2009;55(4):611–622. DOI: 10.1373/clinchem.2008.112797.

5. Eraky S.M., El-Mesery M., El-Karef A., Eissa L.A., El-Gayar A.M. Silymarin and caffeine combination ameliorates experimentally-induced hepatic fibrosis through down-regulation of LPAR1 expression. Biomed. Pharmacother. 2018;101:49–57. DOI: 10.1016/j.biopha.2018.02.064.

6. Everhart J.E., Wright E.C., Goodman Z.D., Dienstag J.L., Hoefs J.C., Kleiner D.E., Ghany M.G., Mills A.S., Nash S.R., Govindarajan S., Rogers T.E., Greenson J.K., Brunt E.M., Bonkovsky H.L., Morishima Ch., Litman H.J., HALT-C Trial Group. Prognostic value of Ishak fibrosis stage: Findings from the hepatitis C antiviral long-term treatment against cirrhosis trial. Hepatology. 2010;51(2):585–594. DOI: 10.1002/hep.23315.

7. Fiddler J.L., Clarke S.L. Evaluation of candidate reference genes for quantitative real-time PCR analysis in a male rat model of dietary iron deficiency. Genes Nutr. 2021;16(1):17. DOI: 10.1186/s12263-021-00698-0.

8. Giri A., Sundar I.K. Evaluation of stable reference genes for qPCR normalization in circadian studies related to lung inflammation and injury in mouse model. Sci. Rep. 2022;12(1):1764. DOI: 10.1038/s41598-022-05836-1.

9. Hayakawa K., Nakanishi M.O., Ohgane J., Tanaka S., Hirosawa M., Soares M.J., Yagi S., Shiota K. Bridging sequence diversity and tissue-specific expression by DNA methylation in genes of the mouse prolactin superfamily. Mamm. Genome. 2012;23(5–6):336–345. DOI: 10.1007/s00335-011-9383-x.

10. Hlaváčková M., Kožichová K., Neckář J., Kolář F., Musters R.J.P., Novák F., Nováková O. Up-regulation and redistribution of protein kinase C-δ in chronically hypoxic heart. Mol. Cell. Biochem. 2010;345(1–2):271–282. DOI: 10.1007/s11010-010-0581-8.

11. Klenke S., Renckhoff K., Engler A., Peters J., Frey U.H. Easy-to-use strategy for reference gene selection in quantitative real-time PCR experiments. Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 2016;389(12):1353–1366. DOI: 10.1007/s00210-016-1305-8.

12. Li Y., Xu Y., Wang R., Li W., He W., Luo X., Ye Y. Expression of Notch-Hif-1α signaling pathway in liver regeneration of rats.J. Int. Med. Res.2020;48(9):300060520943790. DOI: 10.1177/0300060520943790.

13. Liu W., Yu J., Wang Y-F., Shan Q-Q., Wang Y-X. Selection of suitable internal controls for gene expression normalization in rats with spinal cord injury. Neural Regen. Res. 2022;17(6):1387–1392. DOI: 10.4103/1673-5374.327350.

14. Lu X., Liu Y., Zhang D., Liu K., Wang Q., Wang H. Determination of the panel of reference genes for quantitative real-time PCR in fetal and adult rat intestines. Reprod. Toxicol. 2021;104:68–75. DOI: 10.1016/j.reprotox.2021.07.001.

15. Meng Q., Shu B., Sun S., Wang Y., Yang M., Zhu E., Liu A., Gao S., Gou Y., Wang Z. Selection of reference genes for quantitative real-time PCR normalization in the coffee white stem borer, Xylotrechus quadripes Chevrolat (Coleoptera: Cerambycidae). Bull. Entomol. Res. 2022;112(2):151–161. DOI: 10.1017/S0007485321000596.

16. Ruiz-Villalba A., Ruijter J.M., van den Hoff M.J.B. Use and misuse of Cq in qPCR data analysis and reporting. Life (Basel). 2021;11(6):496. DOI: 10.3390/life11060496.

17. Sanders R., Mason D.J., Foy C.A., Huggett J.F. Considerations for accurate gene expression measurement by reverse transcription quantitative PCR when analysing clinical samples. Anal. Bioanal. Chem. 2014;406(26):6471–6483. DOI: 10.1007/s00216-014-7857-x.

18. Schwarz A.P., Kovalenko A.A., Malygina D.A., Postnikova T.Y., Zubareva O.E., Zaitsev A.V. Reference gene validation in the brain regions of young rats after pentylenetetrazole-induced seizures. Biomedicines. 2020;8(8):239. DOI: 10.3390/biomedicines8080239.

19. Schwarz A.P., Malygina D.A., Kovalenko A.A., Trofimov A.N., Zaitsev A.V. Multiplex qPCR assay for assessment of reference gene expression stability in rat tissues/samples. Mol. Cell. Probes. 2020;53:101611. DOI: 10.1016/j.mcp.2020.101611.

20. Svingen T., Letting H., Hadrup N., Hass U., Vinggaard A.M. Selection of reference genes for quantitative RT-PCR (RT-qPCR) analysis of rat tissues under physiological and toxicological conditions. Peer J. 2015;3:e855. DOI: 10.7717/peerj.855.

21. Taylor S.C., Nadeau K., Abbasi M., Lachance C., Nguyen M., Fenrich J. The ultimate qPCR experiment: producing publication quality, reproducible data the first time. Trends Biotechnol. 2019;37(7):761–774. DOI: 10.1016/j.tibtech.2018.12.002.

22. Yang Z., Gao L., Jia H., Bai Y., Wang W. The expression of Shh, Ptch1, and Gli1 in the developing caudal spinal cord of fetal rats with anorectal malformations. J. Surg. Res. 2019;233:173–182. DOI: 10.1016/j.jss.2018.08.006.