Получение сверхстабильной метионинаминопептидазы для удаления метионина из рекомбинантных белков

Отщепление N-концевого инициирующего метионина (Мет1) является критически значимой кои посттрансляционной модификацией, затрагивающей 50–70% клеточных белков. При наработке рекомбинантных белков в гетерологичной системе экспрессии E. сoli отщепление Mет1 часто не происходит, что приводит к гетерогенности получаемых препаратов, изменению их активности и стабильности. Решают эту проблему обработкой рекомбинантных белков in vitro специфическим ферментом — метионинаминопептидазой (МАП). Имеющиеся в настоящее время МАП обладают ограниченными специфичностями и условиями проведения реакций. Нами клонирована МАП из гипертермофильной бактерии, разработана методика очистки фермента, исследован ряд физико-химических свойств. Новый фермент МАП обладает устойчивостью к высоким температурам. МАП сохраняет стабильное нативное состояние в диапазоне рН от 3 до 11 единиц. Новый фермент МАП может быть использования для удаления N-концевого Мет1 из рекомбинантных белков in vitro в широком диапазоне рН и в условиях повышенных температур.

1. Adachi K., et al. Expression of functional soluble human alpha-globin chains of hemoglobin in bacteria. Protein Expr. Purif. 2000;20(1):37–44.

2. Boix E., et al. Role of the N terminus in RNase A homologues: differences in catalytic activity, ribonuclease inhibitor interaction and cytotoxicity. J. Mol. Biol.1996;257(5):992–1007.

3. Bradshaw R.A., Brickey W.W., Walker K.W. N-terminal processing: the methionine aminopeptidase and N alpha-acetyl transferase families. Trends Biochem. Sci. 1998;23(7):263–267.

4. Chen L., Kashina A. Post-translational Modifications of the Protein Termini. Front. Cell Dev. Biol. 2021;9:719590.

5. Endo S., et al. The additional methionine residue at the N-terminus of bacterially expressed human interleukin-2 affects the interaction between the Nand C-termini. Biochemistry. 2001;40(4):914–919.

6. Giglione C., Boularot A., Meinnel T. Protein N-terminal methionine excision. Cell Mol. Life Sci. 2004;61(12):1455–1474.

7. Giglione C., Vallon O., Meinnel T. Control of protein life-span by N-terminal methionine excision. EMBO J. 2003;22(1):13–23.

8. Liao Y.D., et al. The structural integrity exerted by N-terminal pyroglutamate is crucial for the cytotoxicity of frog ribonuclease from Rana pipiens. Nucleic Acids Res. 2003;31(18):5247–5255.

9. Meinnel T., Mechulam Y., Blanquet S. Methionine as translation start signal: a review of the enzymes of the pathway in Escherichia coli. Biochimie. 1993;75(12):1061–1075.

10. Patke S., et al. Characterization of the oligomerization and aggregation of human Serum Amyloid A. PLoS One. 2013;8(6):e64974.

11. Uversky V.N., et al. Structure and stability of recombinant protein depend on the extra N-terminal methionine residue: S6 permutein from direct and fusion expression systems. Biochem. Biophys. Acta. 1999;1432(2):324–332.