Реалии создания гуманизированных трансгенных персонифицированных животных для биомедицинских исследований: переход от плазмидного варианта к рибонуклеопротеиновому комплексу CRISPR/Cas9

Одно из основных направлений деятельности НЦБМТ ФМБА России — создание гуманизированных генно-модифицированных животных для научных и биомедицинских исследований. С использованием классического трансгенеза и плазмидного варианта CRISPR/Cas9-технологии начиная с 2013 года в Центре было получено более 20 линий трансгенных, нокаутных и трансгеннонокаутных животных — мышей-биомоделей. Основными «специализированными» линиями являются гуманизированные трансгенные мыши-биомодели, несущие аллели HLA класса I — HLA-В*, HLA-В**, HLA-В***, HLA-С*, HLA-B*07:02, HLA-С*07:02, HLA-A*02:01, HLA-В*** КО, HLAA** КО, HLA-B**** КО, HLA-С** КО, а также NAT1, NAT2, АСЕ2 hom, hACE2-Tom (HDR-KI), SMN2 (S2), PrPSc, АСЕ2 hom / HLA-C**, β2m мыши KO, PrP КО, STE24 КО, SMN (S6) КО, SMN2 КО, PrP КО / PrPSc, NAT1 KO, NAT2 KO.

В статье анализируются генетические конструкции и методы, с помощью которых получены генномодифицированные животные. Обобщен многолетний опыт применения плазмидного варианта и рассматривается необходимость перехода к рибонуклеопротеиновому комплексу CRISPR/Cas9: высокая эффективность и специфичность, высокая частота целевых модификаций; возможность использования нескольких гРНК; встраивание одной копии HDR-ДНК-матрицы (трансген). Рассматривается возможность замещения импортных реактивов и наборов реагентами отечественного производства.

1. Каркищенко Н.Н., Рябых В.П., Каркищенко В.Н., Колоскова Е.М. Создание гуманизированных мышей для фармакотоксикологических исследований (успехи, неудачи и перспективы). Биомедицина. 2014;1(3):4–22.

2. Каркищенко В.Н., Рябых В.П., Каркищенко Н.Н., Дуля М.С., Езерский В.А., Колоскова Е.М. Лазарев В.Н., Максименко С.В., Петрова Н.В., Столярова В.Н., Трубицына Т.П. Молекулярногенетические аспекты технологии получения трансгенных мышей с интегрированными генами N-ацетилтрансферазы (NAT1 и NAT2) человека. Биомедицина. 2016;1:4–17.

3. Каркищенко В.Н., Болотских Л.А., Капанадзе Г.Д., Каркищенко Н.Н., Колоскова Е.М., Максименко С.В., Матвеенко Е.Л., Петрова Н.В., Рябых В.П., Ревякин А.О., Станкова Н.В., Семенов Х.Х. Создание линий трансгенных животных-моделей с генами человека NAT1 и NAT2. Биомедицина. 2016;1:74–84.

4. Каркищенко В.Н., Берзина А.Г., Петрова Н.В., Помыткин И.А., Глотова Е.С., Петров Д.В., Табоякова Л.А., Болотских Л.А., Ларюшина Н.А. Доказательство наличия целевых белков — β2m hom и HLA у гуманизированных трансгенных мышей линий HLA-A*02:01, HLA-B*07:02 и HLA-C*07:02. Биомедицина. 2024;20(2):32–44. DOI: 10.33647/2074-5982-20-2-32-44

5. Каркищенко Н.Н., Лазарев В.Н., Манувера В.А., Бобровский П.А., Петрова Н.В., Колоскова Е.М., Глотова Е.С. Принципы создания генно-инженерной конструкции для получения гуманизированных трансгенных мышей, несущих ген HLA-С*07:02:01:01, как прообраз инновационных трансгенно-нокаутных биомоделей. Биомедицина. 2024;20(1):8–20. DOI: 10.33647/2074-5982-20-1-8-20.

6. Каркищенко В.Н., Петрова Н.В., Савченко Е.С., Огнева Н.С., Колоскова Е.М., Максименко С.В., Манувера В.А., Бобровский П.А., Лазарев В.Н. Создание полных гибридных ДНК-конструкций с геном человека HLA-A*02:01:01:01. Биомедицина. 2021;17(1):10–23. DOI: 10.33647/2074-5982-17-1-10-23.

7. Каркищенко Н.Н., Глотова Е.С., Петрова Н.В., Слободенюк В.В., Ларюшина Н.А., Петров Д.В., Васильева И.А., Дерябин К.Е. Генетический скрининг новой трансгенной гуманизированной по HLA-A*02:01:01:01 и hβ2m линии мышей. Биомедицина. 2023;19(3E):10–24. DOI: 10.33647/2713-0428-19-3E-10-24.

8. Савченко Е.С., Огнева Н.С., Каркищенко Н.Н. Эмбриологические аспекты создания новой гуманизированной трансгенной линии мышей с интегрированным геном человека HLA-A*02:01:01:01. Биомедицина. 2022;18(4):10–23. DOI: 10.33647/2074-5982-18-4-10-23.

9. Chang H., Pannunzio N.R., Adachi N., Lieber M.R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2017;18(8):495–506. DOI: 10.1038/nrm.2017.48.

10. Concordet J.P., Haeussler M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Res. 2018;46(W1):W242–W245. DOI: 10.1093/nar/gky354.

11. Cong L., Ran F.A., Cox D., Lin S., Barretto R., Habib N., Hsu P.D., Wu X., Jiang W., Marraffini L.A., Zhang F. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013;339(6121):819–823. DOI: 10.1126/science.1231143.

12. Heyer W.D., Ehmsen K.T., Liu J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annu. Rev. Genet. 2010;44:113–139. DOI: 10.1146/annurev-genet-051710-150955.

13. Hsu P.D., Scott D.A., Weinstein J.A., Ran F.A., Konermann S., Agarwala V., Li Y., Fine E.J., Wu X., Shalem O., Cradick T.J., Marraffini L.A., Bao G., Zhang F. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. 2013;31(9):827–832. DOI: 10.1038/nbt.2647.

14. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337(6096):816–821.

15. Mashiko D., Fujihara Y., Satouh Y., Miyata H., Isotani A., Ikawa M. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Sci. Rep. 2013;3:3355. DOI: 10.1038/srep03355

16. Montague T.G., Cruz J.M., Gagnon J.A., Church G.M., Valen E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 2014;42(Web Server issue):W401–W407. DOI: 10.1093/nar/gku410

17. Symington L.S., Gautier J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annu. Rev. Genet. 2011;45:247–271. DOI: 10.1146/annurev-genet-110410-132435.