Метод получения и изучения гелевого раствора с агаром для сохранения электрической активности срезов мозга крыс после их длительного криосохранения

Биотехнология криосохранения позволяет длительно сохранять и восстанавливать биологические объекты. Она необходима для создания криобанка. Мы разработали двухкомпонентный замораживающий раствор, состоящий из искусственной цереброспинальной жидкости и агара в различных концентрациях. Эффективность раствора для длительного криосохранения (–10°С, 52 сут.) была исследована на переживающих срезах обонятельной коры мозга негибернирующих животных — крыс. В качестве функциональных индикаторов успешного криосохранения жизнеспособности срезов мозга были изучены изменения активностей a-амино-3-гидрокси-5-метилизоксазол-4-пропионовой кислоты (АМПА) и N-метил-D-аспартата (НМДА) глутаматергических механизмов. Были использованы различные концентрации агара: 33%, 44% и 50%. При концентрации 33% наблюдалась гиперактивация АМПА и восстановление НМДА механизмов по сравнению со значениями до криосохранения. При концентрации агара 44% происходила гиперактивация обоих механизмов. Полное восстановление активностей АМПА и НМДА механизмов после длительного криосохранения было достигнуто при концентрации агара 50%. Разработанный и исследованный нами замораживающий раствор на основе агара не содержит «тяжёлых» протекторов (диметилсульфоксида), антибиотиков, а также катионов, таких как Ba2+ и Sr2+, которые приводят к необратимой блокаде АМПА и НМДА механизмов. Таким образом, замораживающий раствор на основе агара способствует сохранению высокого уровня активности АМПА и НМДА механизмов в переживающих срезах при криосохранении. Разработанный раствор можно использовать для создания криобанка нервной ткани.

1. Мокрушин А.А., Боровиков С.Е. Установка для изучения гипотермических эффектов на переживающих срезах мозга теплокровных. Международный журнал прикладных фундаментальных исследований. 2017;2(2):214–217.

2. Мокрушин А.А. Криосохранение срезов мозга крыс с различной длительностью и восстановление их электрической активности. Биомедицина. 2019;15(4):98–106. DOI: 10.33647/2074-5982-15-4-98-106.

3. Мокрушин А.А. Оптимизация кислотно-щелочного состава инкубационной среды для длительной и обратимой криоконсервации срезов мозга негибернирующих животных. Биофизика. 2021;66(5):954–963. DOI: 10.31857/S0006302921050136.

4. Пичугин Ю.И. Теоретические и практические аспекты современной криобиологии. М.: Научно-технический центр криобиологии и анабиоза, 2013:60–62.

5. Шипунов Б.П., Коптев В.Е., Маркин В.И. Особенности реологии растворов агар-агара. Химия растительного сырья. 2018;1:53–60.

6. Усов А.И. Проблемы и достижения в структурном анализе сульфатированных полисахаридов красных водорослей. Химия растительного сырья. 2001;2:7–20.

7. Bakhach J. The cryopreservation of composite tissues: Principles and recent advancement on cryopreservation of different type of tissues. Organogenesis. 2009;5:119–126. DOI: 10.4161/org.5.3.9583.

8. Benson E.E., Harding K., Ryan M., Petrenko A., Petrenko Y. Alginate encapsulation to enhance biopreservation scope and success: A multidisciplinary review of current ideas applications in cryopreservation and non-freezing storage. Cryoletters. 2018;39(1):14–38.

9. Day A.G.E., Bhangra K.S., Murray-Dunning C., Stevanato L., Phillips J.B. The effect of hypothermic and cryogenic preservationon engineered neural tissue. Tissue engineering. Part C: Methods. 2017;23(10):575–582. DOI: 10.1089/ten.TEC.2017.0244.

10. Mokrushin A.A., Pavlinova L.I. Effects of the blood components on the AMPA and NMDA synaptic responses in brain slices in the onset of hemorrhagic stroke. Gen. Physiol. Biophys. 2013;32(4):489–504. DOI: 10.4149/gpb_2013038.

11. Mokrushin A.A. Effects cryopreservation of ionotropic glutamatergic receptor mechanisms in vitro. CryoLetters. 2015;36(6):367–377.

12. Parker S.S., Moutal A., Cai S., Chandrasekaran S., Roman M.R., Koshy A.A., Khanna R., Zinsmaier K.E., Mouneimne G. High fidelity cryopreservation and recovery of primary rodent cortical neurons. eNeuro. 2018;5(5):Eneuro 0135-18. DOI: 10.1523/ENEURO.0135-18.2018.

13. Pischedda F., Montani C., Obergasteiger J., Frapporti G., Corti C., Rosato Siri M., Volta M., Piccoli G. Cryopreservation of primary mouse neurons: The benefit of neurofreezing cryoprotective medium. Front. Cell. Neurosci. 2018;12:81. DOI: 10.3389/fncel.2018.00081.

14. Sousa A.M., Borges J., Silva A.F., Gonçalves M.P. Influence of the extraction process on the rheological and structural properties of agars. Carbohydr. Polym. 2013;96(1):163–171. DOI: 10.1016/j.carbpol.2013.03.070.

15. Zhang C., Zhou Y., Zhang L., Wu L., Chen Y., Xie D., Chen W. Hydrogel cryopreservation system: An effective method for cell storage. Int. J Mol. Sci. 2018;19(11):3330. DOI: 10.3390/ijms19113330.