Метод получения и изучения гелевого раствора с агаром для сохранения электрической активности срезов мозга крыс после их длительного криосохранения
https://doi.org/10.33647/2074-5982-18-2-31-39
Аннотация
Биотехнология криосохранения позволяет длительно сохранять и восстанавливать биологические объекты. Она необходима для создания криобанка. Мы разработали двухкомпонентный замораживающий раствор, состоящий из искусственной цереброспинальной жидкости и агара в различных концентрациях. Эффективность раствора для длительного криосохранения (–10°С, 52 сут.) была исследована на переживающих срезах обонятельной коры мозга негибернирующих животных — крыс. В качестве функциональных индикаторов успешного криосохранения жизнеспособности срезов мозга были изучены изменения активностей a-амино-3-гидрокси-5-метилизоксазол-4-пропионовой кислоты (АМПА) и N-метил-D-аспартата (НМДА) глутаматергических механизмов. Были использованы различные концентрации агара: 33%, 44% и 50%. При концентрации 33% наблюдалась гиперактивация АМПА и восстановление НМДА механизмов по сравнению со значениями до криосохранения. При концентрации агара 44% происходила гиперактивация обоих механизмов. Полное восстановление активностей АМПА и НМДА механизмов после длительного криосохранения было достигнуто при концентрации агара 50%. Разработанный и исследованный нами замораживающий раствор на основе агара не содержит «тяжёлых» протекторов (диметилсульфоксида), антибиотиков, а также катионов, таких как Ba2+ и Sr2+, которые приводят к необратимой блокаде АМПА и НМДА механизмов. Таким образом, замораживающий раствор на основе агара способствует сохранению высокого уровня активности АМПА и НМДА механизмов в переживающих срезах при криосохранении. Разработанный раствор можно использовать для создания криобанка нервной ткани.
Ключевые слова
Об авторе
А. А. МокрушинРоссия
д.б.н.,
199034, Российская Федерация, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6
Список литературы
1. Мокрушин А.А., Боровиков С.Е. Установка для изучения гипотермических эффектов на переживающих срезах мозга теплокровных. Международный журнал прикладных фундаментальных исследований. 2017;2(2):214–217.
2. Мокрушин А.А. Криосохранение срезов мозга крыс с различной длительностью и восстановление их электрической активности. Биомедицина. 2019;15(4):98–106. DOI: 10.33647/2074-5982-15-4-98-106.
3. Мокрушин А.А. Оптимизация кислотно-щелочного состава инкубационной среды для длительной и обратимой криоконсервации срезов мозга негибернирующих животных. Биофизика. 2021;66(5):954–963. DOI: 10.31857/S0006302921050136.
4. Пичугин Ю.И. Теоретические и практические аспекты современной криобиологии. М.: Научно-технический центр криобиологии и анабиоза, 2013:60–62.
5. Шипунов Б.П., Коптев В.Е., Маркин В.И. Особенности реологии растворов агар-агара. Химия растительного сырья. 2018;1:53–60.
6. Усов А.И. Проблемы и достижения в структурном анализе сульфатированных полисахаридов красных водорослей. Химия растительного сырья. 2001;2:7–20.
7. Bakhach J. The cryopreservation of composite tissues: Principles and recent advancement on cryopreservation of different type of tissues. Organogenesis. 2009;5:119–126. DOI: 10.4161/org.5.3.9583.
8. Benson E.E., Harding K., Ryan M., Petrenko A., Petrenko Y. Alginate encapsulation to enhance biopreservation scope and success: A multidisciplinary review of current ideas applications in cryopreservation and non-freezing storage. Cryoletters. 2018;39(1):14–38.
9. Day A.G.E., Bhangra K.S., Murray-Dunning C., Stevanato L., Phillips J.B. The effect of hypothermic and cryogenic preservationon engineered neural tissue. Tissue engineering. Part C: Methods. 2017;23(10):575–582. DOI: 10.1089/ten.TEC.2017.0244.
10. Mokrushin A.A., Pavlinova L.I. Effects of the blood components on the AMPA and NMDA synaptic responses in brain slices in the onset of hemorrhagic stroke. Gen. Physiol. Biophys. 2013;32(4):489–504. DOI: 10.4149/gpb_2013038.
11. Mokrushin A.A. Effects cryopreservation of ionotropic glutamatergic receptor mechanisms in vitro. CryoLetters. 2015;36(6):367–377.
12. Parker S.S., Moutal A., Cai S., Chandrasekaran S., Roman M.R., Koshy A.A., Khanna R., Zinsmaier K.E., Mouneimne G. High fidelity cryopreservation and recovery of primary rodent cortical neurons. eNeuro. 2018;5(5):Eneuro 0135-18. DOI: 10.1523/ENEURO.0135-18.2018.
13. Pischedda F., Montani C., Obergasteiger J., Frapporti G., Corti C., Rosato Siri M., Volta M., Piccoli G. Cryopreservation of primary mouse neurons: The benefit of neurofreezing cryoprotective medium. Front. Cell. Neurosci. 2018;12:81. DOI: 10.3389/fncel.2018.00081.
14. Sousa A.M., Borges J., Silva A.F., Gonçalves M.P. Influence of the extraction process on the rheological and structural properties of agars. Carbohydr. Polym. 2013;96(1):163–171. DOI: 10.1016/j.carbpol.2013.03.070.
15. Zhang C., Zhou Y., Zhang L., Wu L., Chen Y., Xie D., Chen W. Hydrogel cryopreservation system: An effective method for cell storage. Int. J Mol. Sci. 2018;19(11):3330. DOI: 10.3390/ijms19113330.
Рецензия
Для цитирования:
Мокрушин А.А. Метод получения и изучения гелевого раствора с агаром для сохранения электрической активности срезов мозга крыс после их длительного криосохранения. БИОМЕДИЦИНА. 2022;18(2):31-39. https://doi.org/10.33647/2074-5982-18-2-31-39
For citation:
Mokrushin A.A. Method for Obtaining and Studying a Gel Agar-Based Medium to Preserve the Electrical Activity of Rat Brain Slices after their Long–Term Cryopreservation. Journal Biomed. 2022;18(2):31-39. (In Russ.) https://doi.org/10.33647/2074-5982-18-2-31-39