Генетический скрининг новой трансгенной гуманизированной по HLA-A*02:01:01:01 и hβ2m линии мышей

Создание новой гуманизированной трансгенной линии мышей-биомоделей, несущих ген HLA-A*02:01:01:01, требует разработки эффективного метода верификации наличия целевого трансгена в геноме животных. Нами была разработана система генетического скрининга животных на основе метода ПЦР в реальном времени и высокоспецифичных праймеров, позволяющих детектировать все функционально значимые части генетической конструкции. Кроме того, методом секвенирования по Сэнгеру было показано отсутствие химеризма и полное соответствие первичной нуклеотидной последовательности трансгена HLA-A*02:01:01:01 заявленной генно-инженерной конструкции и гену HLA-A*02:01:01:01 человека. По результатам селекционно-генетической работы с полученными трансгенными животными были определены три наиболее перспективные сублинии, которые используются для выведения новой линии гуманизированных трансгенных мышей, несущих ген HLA-A*02:01:01:01.

1. Каркищенко В.Н., Болотских Л.А., Капанадзе Г.Д., Каркищенко Н.Н., Колоскова Е.М., Максименко С.В., Матвеенко Е.Л., Петрова Н.В., Рябых В.П., Ревякин А.О., Станкова Н.В., Семёнов Х.Х. Создание линий трансгенных животных-моделей с генами человека NAT1 и NAT2. Биомедицина. 2016;1:74–84.

2. Каркищенко В.Н., Рябых В.П., Болотских Л.А., Семенов Х.Х., Капанадзе Г.Д., Петрова Н.В., Езерский В.А., Жукова О.Б., Колоскова Е.М., Максименко С.В., Столярова В.Н., Трубицина Т.П. Физиолого-эмбриологические аспекты создания трансгенных мышей с интегрированными генами NAT1 и NAT2 человека. Биомедицина. 2016;1:52–65.

3. Каркищенко В.Н., Рябых В.П., Каркищенко Н.Н., Дуля М.С., Езерский В.А., Колоскова Е.М., Лазарев В.Н., Максименко С.В., Петрова Н.В., Столярова В.Н., Трубицина Т.П. Молекулярногенетические аспекты технологии получения трансгенных мышей с интегрированными генами N-ацетилтрансферазы (NAT1 и NAT2) человека. Биомедицина. 2016;1:4–17.

4. Каркищенко Н.Н., Петрова Н.В., Слободенюк В.В. Высокоспецифичные видовые праймеры к генам Nat1 и Nat2 для сравнительных исследований у человека и лабораторных животных. Биомедицина. 2014;1(2):4–24.

5. Помыткин И.А., Каркищенко В.Н., Фокин Ю.В., Нестеров М.С., Петрова Н.В. Модель фатального острого поражения легких и острого респираторного дистресс-синдрома. Биомедицина. 2020;16(4):24–33. DOI: 10.33647/2713-0428-16-4-24-33.

6. Савченко Е.С., Огнева Н.С., Каркищенко Н.Н. Эмбриологические аспекты создания новой гуманизированной трансгенной линии мышей с интегрированным геном человека HLA-A*02:01:01:01. Биомедицина. 2022;18(4):10–23.

7. Aigner B., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. Journal of molecular medicine. 2010;88:653–664.

8. Bai J., Wang J., Yang Y., Wang F., He A., Zhang W. Identification of HLA-A*0201-restricted CTL Epitopes for MLAA-34-specific Immunotherapy for Acute Monocytic Leukemia. J. Immunother. 2021;44(4):141–150.

9. Beckford-Vera D.R., Gonzalez-Junca A., Janneck J.S., Huynh T.L., Blecha J.E., Seo Y., Li X., VanBrocklin H.F., Franc B.L. PET/CT Imaging of Human TNFα Using [89Zr] Certolizumab Pegol in a Transgenic Preclinical Model of Rheumatoid Arthritis. Mol. Imaging Biol. 2020;22(1):105–114.

10. Carter D.B., et al. Phenotyping of transgenic cloned piglets. Cloning and stem cells. 2002;4:131–145.

11. Chen Z., Ruan P., Wang L., Nie X., Ma X., Tan Y. T and B cell Epitope analysis of SARS-CoV-2 S protein based on immunoinformatics and experimental research. J. Cell Mol. Med. 2021.

12. Chu M.L., Moran E. The Limb-Girdle Muscular Dystrophies: Is Treatment on the Horizon? Neurotherapeutics. 2018;15(4):849–862.

13. Giraldo P., Rival-Gervier S., Houdebine L.M., Montoliu L. The potential benefits of insulators on heterologous constructs in transgenic animals. Transgenic Res. 2003;12:751–755.

14. Levedakou E.N., Popko B. Rewiring enervated: thinking LARGEr than myodystrophy. J. Neurosci. Res. 2006;84(2):237–243.

15. Ma L., Wang Y., Wang H., Hu Y., Chen J., Tan T., Hu M., Liu X., Zhang R., Xing Y., Zhao Y., Hu X., Li N. Screen and Verification for Transgene Integration Sites in Pigs. Sci. Rep. 2018;8(1):7433.

16. Paquet D., Kwart D., Chen A., et al. Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9. Nature. 2016;533:125–129.

17. Rogers C.S., et al. Disruption of the CFTR gene produces a model of cystic fibrosis in newborn pigs. Science. 2008;321:1837–1841.

18. Russell W.M.S. BRL. The Principles of Humane Experimental Technique. Med. J. Aust. [Internet]. 1960;1(13):500.

19. Schroder A.R.W., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 2002;110:521–529.

20. Thomas R., Shaath H., Naik A., Toor S.M., Elkord E., Decock J. Identification of two HLA-A*0201 immunogenic epitopes of lactate dehydrogenase C (LDHC): potential novel targets for cancer immunotherapy. Cancer Immunol. Immunother. 2020;69(3):449–463.

21. Valkenburg S.A., Josephs T.M., Clemens E.B., Grant E.J., Nguyen T.H., Wang G.C., Price D.A., Miller A., Tong S.Y., Thomas P.G., Doherty P.C., Rossjohn J., Gras S., Kedzierska K. Molecular basis for universal HLA-A*0201-restricted CD8+ T-cell immunity against influenza viruses. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2016;113(16):4440–4445.

22. van Vuuren A.J., van Roon J.A., Walraven V., Stuij I., Harmsen M.C., McLaughlin P.M., van de Winkel J.G., Thepen T. CD64-directed immunotoxin inhibits arthritis in a novel CD64 transgenic rat model. J. Immunol. 2006;176(10):5833–5838.

23. Yang D.S., et al. Expression of Huntington’s disease protein results in apoptotic neurons in the brains of cloned transgenic pigs. Hum. Mol. Genet. 2010;19:3983–3994.