Молекулярно-генетические аспекты технологии получения трансгенных мышей с интегрированными генами N-ацетилтрансферазы (NAT1 и NAT2) человека

В ходе работы были созданы ДНК-конструкции, включающие нуклеотидные последовательности генов NAT1 и NAT2 человека и промоторно-энхансерную область гена альбумина мыши. Кодирующие части генов NAT1 и NAT2 были амплифицированы с матрицы геномной ДНК человека с использованием олигонуклеотидов NAT1-Not и NAT1-Xho в случае NAT1 и NAT2-Not и NAT2-Xho - в случае NAT2 . Плазмиды pSI-NAT1 и pSI-NAT2 расщепляли эндонуклеазами BamHI и EcoRV (сайт рестрикции EcoRV был введен в олигонуклеотид enAlb-F). Параллельно осуществлялся синтез олигонуклеотидных праймеров и детекция экспрессии генов у людей и создаваемых трансгенных животных с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров. На следующих этапах осуществлялось выделение ДНК/РНК из пробы плазмы крови, амплификация геномной ДНК, идентификация ПЦР-продуктов методом горизонтального электрофореза. Наличие в геле полоски ДНК соответствующего размера свидетельствовало о наличии в образце искомого гена. Получены трансгенные мыши (F0) с интегрированными в их геном конструкциями, включающими нуклеотидные последовательности генов NAT1 и NAT2 человека под промотором гена альбумина мыши. Общая эффективность трансгеноза составила для гена NAT1 - 1,1% и для NAT2 - 0,6%. Анализ интеграции трансгенов в различных органах и тканях у потомков (F1) первичных трансгенных мышей (F0) показал, что встраивание генов NAT1 и NAT2 человека произошло во все три зародышевых листка.

ДНК-конструкции генов NAT1 и NAT2, промоторно-энхансерная область гена, плазмиды, высокоспецифичные праймеры, детекция экспрессии генов, амплификация, трансгеноз

1. Езерский В.А., Тевкин С.И., Трубицина Т.П., Колоскова Е.М., Шишиморова М.С., Безбородова О.А., Якубовская Р.И., Рябых В.П. Интеграция и тканеспецифическая экспрессия гена лактоферрина человека в молочной железе трансгенных кроликов // Проблемы биологии продуктивных животных. 2013. № 4. С. 33-52.

2. Каркищенко Н.Н., Рябых В.П., Каркищенко В.Н., Колоскова Е.М. Создание гуманизированных мышей для фармакотоксилогических исследований (успехи, неудачи и перспективы) // Биомедицина. 2014. № 3. С. 4-22.

3. Каркищенко Н.Н., Петрова Н.В., Слободенюк В.В. Высокоспецифичные видовые праймеры к генам NAT1 и NAT2 для сравнительных исследований у человека и лабораторных животных // Биомедицина. 2014. № 2. С. 4- 17.

4. Blin N., Stafford D.W. A general method for isolation of high molecular weight DNA from eukaryotes // Nucleic acids res. 1976. No. 3(9). Pp. 2303-8.

5. Boukouvala S., Fakis G. Arylamine N-acetyltransferases: what we learn from genes and genomes // Drug metabolism reviews. 2005. No. 37. Pp. 511-564.

6. Butcher N.J., Arulpragasam A., Goh H.L., Davey T., Minchin R.F. Human arylamine N-acetyltransferase-1 interacts with EHZF, a multi-functional transcription co-factor // In: Third International Workshop on Arylamine N-acetyltransferases. -Vancouver, Canada. 2004.

7. Cao W., Chau B., Hunter R., Strnatka D., McQueen C.A., Erickson R.P. Only low levels of exogenous N-acetyltransferase can be achieved in transgenic mice // Pharmacogenetics J. 2005. No. 5. Pp. 255-261.

8. Cornish V.A., Pinter K., Boukouvala S., Johnson N., Labrousse C., Payton M., Priddle H., Smith A.J., Sim E. Generation and analysis of mice with a targeted disruption of the arylamine N-acetyltransferase type 2 gene // Pharmacogenomics J. 2003. No. 3. Pp. 169-177.

9. Coughtrie M.W.H., Sharp S., Maxwell K., Innes N.P. Biology and function of the reversible sulfation pathway catalysed by human sulfotransferases and sulfatases // Chem.-biol. interact. 2003. No. 109. Pp. 3-27.

10. Erickson R., Morgan C., McQueen C.A. 2nd International NAT Workshop. - Eynsham, Oxford. 2000. Abstract. No. 1.

11. Green M.D., Tephly T.R. Glucuronidation of amine substrates by purified and expressed UDP-glucuronosyltransferase proteins // Drug metab. dispos. 1998. No. 26. Pp. 860-867.

12. Karolyi J., Erickson R.P., Liu S. Genetics of susceptibility to 6-aminonicotinamide-induced cleft palate in the mouse: studies in congenic and recombinant inbred strains // Teratology. 1988. No. 37. Pp. 283-287.

13. Karolyi J., Erickson R.P., Liu S., Killewald L. Major effects on teratogen-induced facial clefting in mice determined by a single genetic region // Genetics. 1990. No. 126. Pp. 201-205.

14. Leff M.A., Epstein P.N., Doll M.A., Fretland A.J., Devanaboyina U.S., Rustan T.D., Hein D.W. Prostate-specific human N-acetyltransferase 2 (NAT2) expression in the mouse // J. Pharmacol. exp. ther. 1999. No. 290(1). Pp. 182-187.

15. Nebert D.W. Polymorphisms in drug metabolising enzymes: what is their clinical relevance and why do they exist? // Am. J. hum. genet. 1997. No. 60. Pp. 265-271.

16. Nelson D.R., Koymans L., Kamataki T., Stegeman J.J., Feyereisen R., Waxman D.J., Waterman M.R., Gotoh O., Coon M.J., Estabrook R.W., Gunsalus I.C., Nebert D.W. P450 superfamily: update on new sequences, gene mapping, accession numbers and nomenclature // Pharmacogenetics. 1996. No. 6. Pp. 1-42.

17. Sim E., Pinter K., Mushtaq A., Upton A., Sandy J., Bhakta S., Noble M. Arylamine N-acetyltransferases: a pharmacogenomic approach to drug metabolism and endogenous function // Biochem. soc. trans. 2003. No. 31. Pp. 615-619.

18. Sugamori K.S., Wong S., Brenneman D., Lu X., Grant D.M. NAT3 knockout or over expression in mice has no influence on N-acetylation activity // Drug metab. rev. 2004. No. 36. 164 p.

19. Sugamori K.S., Wong S., Gaedigk A., Yu V., Abramovici H., Rozmahel R., Grant D.M. Generation and functional characterization of arylamine N-acetyltransferase Nat1/Nat2 double-knockout mice // Mol. pharmacol. 2003. No. 64. Pp. 170-179.

20. Wong L.-L. Cytochrome P450 monooxygenases // Curr. opin. chem. biol. 1998. No. 2. Pp. 263-268.