Оптимизация очистки антигенных комплексов Klebsiella pneumoniae методом диафильтрации от гидроксиламина

Распространенность и антибиотикорезистентность бактерий группы ESKAPE вызывает трудности в их профилактике и лечении. В лаборатории протективных антигенов ФГБНУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» ведется разработка иммуностимулирующих препаратов для профилактики заболеваний, вызываемых некоторыми представителями этой группы, в т. ч. Klebsiella pneumoniae. При выделении протективного антигена в качестве инактивирующего агента в процессе производства препарата используется гидроксиламин, обладающий токсичными для организма человека свойствами. Очистку конечного продукта от него затрудняет полисахаридная капсула, выделяемая K. pneumoniae. Цель работы состояла в оценке эффективности используемых для диафильтрации различных отмывающих растворов и их влияния на специфическую активность и химический состав получаемых антигенных комплексов K. pneumoniae. В исследовании использовали штамм K. pneumoniae 204, выращенный глубинным культивированием. Клетки полученной культуры выделяли методом центрифугирования и инактивировали гидроксиламином. Удаление инактивирующего агента проводили методом ультрафильтрации в режиме диафильтрации с использованием воды или буферов Tris-HCl pH=9,0 различных концентраций. Полученные антигены оценивали по содержанию остаточного гидроксиламина, полисахаридов, белка методом Лоури, нуклеиновых кислот методом Спирина и специфической активности методом РТПГА. Получены образцы антигенсодержащей жидкости K. pneumoniae 204. При использовании в процессе удаления гидроксиламина буферов Tris-HCl pH=9,0 содержание гидроксиламина снижалось до допустимых значений (менее 1 мкг/мл) при использовании 25-кратного объема раствора в любой из исследованных концентраций. Тогда как при использовании дистиллированной воды в качестве очищающего раствора в тех же объемах добиться аналогичного результата не получалось. Проведен анализ химического состава полученных антигенных комплексов. Применение буферного раствора Tris-HCl pH=9,0 10 мМ для удаления гидроксиламина из антигенсодержащей жидкости K. pneumoniae оптимально и не влияет на химический состав и активность ее антигенных комплексов.

1. МУК 4.1/4.2.588-96 «Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям».

2. ОФС.1.7.2.0008.15 «Определение концентрации клеток микроорганизмов».

3. ОФС.1.7.2.0018.15 Определение нуклеиновых кис лот по методу Спирина в биологических лекарственных препаратах.

4. ОФС.1.2.3.0019.15 Определение сахаров спектрофотометрическим методом.

5. Cakmakci M.L., Evans H.J., Seidler R.J. Characte ristics of nitrogen-fixing Klebsiella oxytoca isolat ed from wheat roots. Plant soil. 1981;61(1):53–63. DOI: 10.1007/BF02277362.

6. Gorrie C.L., Mirceta M., Wick R.R., Edwards D.J., Thomson N.R., Strugnell R.A., et al. Gastrointestinal Carriage Is a Major Reservoir of Klebsiella pneumo niae Infection in Intensive Care Patients. Clin. Infect. Dis. 2017;65(2):208–215.

7. Huang M., Lin L., Wu Y., Honhing H., He P., Li G., He P., et al. Pathogenicity of Klebsiella pneumonia (KpC4) infecting maize and mice. J. Integr. Agric. 2016;15(7):1510–1520. DOI: 3119(16)61334-5. 10.1016/S2095

8. Kumar P., Dash B., Suyal D.C., Gupta S.B., Singh A.K., Chowdhury T., et al. Characterization of Arsenic-Resistant Klebsiella pneumoniae RnASA11 from Contaminated Soil and Water Samples and Its Bioremediation Potential. Curr. Microbiol. 2021;78(8):3258–3267. DOI: 10.1007/s00284-02102602-w.

9. Li B., Zhao Y., Liu C., Chen Z., Zhou D. Molecular patho genesis of Klebsiella pneumoniae. Future Microbiol. 2014;9(9):1071–1081. DOI: 10.2217/fmb.14.48.

10. Marques C., Menezes J., Belas A., Aboim C., Cavaco Silva P., Trigueiro G., et al. Klebsiella pneumoniae causing urinary tract infections in companion animals and humans: population structure, antimicrobial resis tance and virulence genes. J. Antimicrob. Chemother. 2019;74(3):594–602. DOI: 10.1093/jac/dky499.

11. Pendleton J.N., Gorman S.P., Gilmore B.F. Clinical relevance of the ESKAPE pathogens. Expert Rev. Anti Infect. Ther. 2013;11(3):297–308. DOI: 10.1586/eri.13.12.

12. Pereira S.G., Alarico S., Tiago I., Reis D., Nunes Costa D., Cardoso O., et al. Studies of antimicrobi al resistance in rare mycobacteria from a nosoco mial environment. BMC Microbiol. 2019;19(1):62. DOI: 10.1186/s12866-019-1428-4.

13. Rendueles O. Deciphering the role of the capsule of Klebsiella pneumoniae during pathogenesis: A cau tionary tale. Mol. Microbiol. 2020;113(5):883–888. DOI: 10.1111/mmi.14474.

14. Wyres K.L., Holt K.E. Klebsiella pneumoniae as a key trafficker of drug resistance genes from to clinically important bacteria. Curr. Opin. Microbiol. 2018;45:131–139. DOI: 10.1016/j.mib.2018.04.004.

15. Zadoks R.N., Griffiths H.M., Munoz M.A., Ahlstrom C., Bennett G.J., Thomas E., et al. Sources of Klebsiella and Raoultella species on dairy farms: be careful where you walk. J. Dairy Sci. 2011;94(2):1045–1051. DOI: 10.3168/jds.2010-3603.environmental