Использование метода микроинъекции для повышения эффективности выделения первичных колоний из бластоцист инбредных мышей в условиях культуры in vitro

Оценены перспективы использования метода микроинъекции для выделения из бластоцист инбредных линий мышей клеток внутренней клеточной массы и трофобласта - источников новых линий стволовых клеток эмбрионального происхождения. Показано, что после микроинъекции в полость бластоцисты 10 нл модифицированной среды Виттена и/или витальных красителей (0,03% трипанового синего и 0,1% фенолового красного) повреждается не более 4-5% клеток по ходу прокола. При этом происходят видимые изменения морфологии бластоцисты, которые практически полностью нивелируют в течение первых 24 ч инкубирования в модифицированной среде Виттена. Показано, что процедура микроинъекции не влияет на последующее развитие инъецированных бластоцист до стадии формирования in vitro первичных колоний, представляющих собой единую популяцию взаимодействующих между собой клеток внутренней клеточной массы и трофобласта. Показано также, что механический прокол блестящей оболочки ( zona pellucida ) и осмотический шок от введения избыточного количества жидкости во внутреннюю полость бластоцисты способствуют выходу бластоцисты из z. pellucida и колониеобразованию (для мышей линий NMRI и SHK - до 93 и 78%, против 47 и 44% в контроле, соответственно). Таким образом, микроинъекция небольших объемов сбалансированных по солевому составу сред и/или растворов витальных красителей (не более 10 нл) может служить вспомогательным приемом для более эффективного выделения первичных колоний из бластоцист мышей с разным генотипом и создания на основе клеток внутренней клеточной массы и трофобласта новых экспериментальных моделей для медико-биологических исследований.

микроинъекция, стадия бластоцисты, клетки внутренней клеточной массы, трофобласт

1. Межевикина Л.М., Федорова В.В., Капралова И.В., Фесенко Е.Е. Повышение выживаемости доимплантационных зародышей мыши в среде с рекомбинантным цитокином LIF // Онтогенез. 2006. Т. 37. № 1. С. 55-62.

2. Рожкова И.Н., Брусенцев Е.Ю., Амстиславский С.Я. Оболочки преимплантационных зародышей млекопитающих как мишень репродуктивных технологий // Онтогенез. 2012. Т. 43. № 5. С. 309-319.

3. Сахарова Н.Ю., Межевикина Л.М., Смирнов А.А., Вихлянцева Е.Ф. Анализ действия синего света на морфофункциональное состояние бластоцист при культивировании in vitro с использованием мышей, несущих ген улучшенного зеленого флуоресцирующего белка (EGFP) // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2014. № 1. С. 52-56.

4. Храмцова Е.А., Межевикина Л.М., Фесенко Е.Е. Роль клеток трофобласта в регуляции выживаемости бластоцист мыши in vitro после микроинъекции и осмотического шока // Биофизика. 2014. Т. 49. Вып. 2. С. 314-321.

5. Barcroft L.C., Offenberg H., Thomsen P., Watson A.J. Aquaporin proteins in murine trophectoderm mediate transepithelial water movements during cavitations // Dev. Biol. 2003. V. 256. Pp. 342-254.

6. Buecker C., Chen H.H., Polo J.M., Daheron L., Bu L., Barakat T.S., Okwieka P., Porter A., Gribnau J., Hochedlinger K., Geijsen N. A murine ESC-like state facilitates transgenesis and homologous recombination in human pluripotent stem cells // Cell Stem Cell. 2010. V. 6. № 6. Pp. 535-546.

7. Chambers I., Colby D., Robertson M., Nichols J., Lee S., Tweedie S., Smith A. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells // Cell. 2003. V. 113. Pp. 643-655.

8. Fedorov L.M., Haegel-Kronenberger H., Hirchenhain J. A comparison of the germline potential of differently aged ES cell lines and their transfected descendants // Transgenic Research. 1997. V. 6. Pp. 223-231.

9. Gao S., McGarry M., Ferrier T., Pallante B., Gasparrini B., Fletcher J., Harkness L., De Sousa P., McWhir J., Wilmut I. Effect of cell confluence on production of cloned mice using an inbred embryonic stem cell line // Biol. reprod. 2003 V. 68. № 2. Pp. 595-603.

10. Guo J., Jauch A., Holtgreve-Grez H., Schoell B., Erz D., Schrank M., Janssen J.W.G. Multicolor karyotipe analyses of mouse embryonic stem cells in vitro // Cell. devel. biol. animal. 2005. V. 41. Pp. 278-283.

11. Hanna J., Chenga A.W., Sahaa K., Kim J., Lengner C.J., Soldner F., Cassadya J.P., Muffat J., Careya B.W., Jaenisch R. Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. V. 107. № 20. Pp. 9222-9227.

12. Hwang W.S., Lee E., Chung Y., et al. Intactness of zona pellucida does not affect the secretion of a trypsin-like protease from mouse blastocyst // J. Korean. med. sci. 2000. V. 15. № 5. Pp. 529-532.

13. Kawase E., Suemori H., Takahashi N., Okazaki K., Hashimoto K., Nakatsuji N. Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines // Int. J. dev. biol. 1994. V. 38. № 2. Pp. 385-390.

14. Kim H.S., Oh S.K., ParkY.B., Ahn HSuh C.S., Kim S.H., Kim D.-W., Moon S.Y. Methods for derivation of human embryonic stem cells // Stem cells. 2005. V. 23. Pp. 1228-1233.

15. Mitsui K., Tokuzawa Y., Itoh H., Segawa K., Murakami M., Takahashi K., Maruyama M., Maeda M., Yamanaka S. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells // Cell. 2003. V. 113. Pp. 631-642.

16. Nagy A., Gertsenstein M., Vintersten K., Behringer R. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual // Cold spring harbor laboratory press. - New York. 2003.

17. Nichols J., Zevnik B., Anastassiadis K., Niwa H., Klewe-Nebenius D., Chambers I., Scholer H., Smith A. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor // Cell. 1998. V. 95. № 30. Pp. 379-391.

18. Rossant J. Stem cells from the mammalian blastocyst // Stem Сells. 2001. V. 19. Pp. 477-482.

19. Suzuki H., Kamada N., Ueda O., Jishage K., Kurihara Y., Kurihara H., Terauchi Y., Azuma S., Kadowaki T., Kodama T., Yazaki Y., Toyoda Y. Germ-line contribution of embryonic stem cells in chimeric mice: influence of karyotype and in vitro differentiation ability // Exp. Anim. 1997. V. 46. № 1. Pp. 17-23.

20. Tam P.P., Zhou S.X. The allocation of epiblast cells to ectodermal and germ-line lineages is influenced by the position of the cells in the gastrulating mouse embryo // Dev. biol. 1996. V. 178. № 1. Pp. 124-132.

21. Watson A.J., Barcroft L.C. Regulation of blastocyst formation // Frontiers in Bioscience. 2001. V. 6. Pp. 708-730.

22. Wiemer K.E., Garrisi J., Steuerwald N., et al. Beneficial aspects of co-culture with assisted hatching when applied to multiple-failure in vitro fertilization patients // Hum. reprod. 1996. V. 11. № 11. Pp. 2429-2433.

23. Yagi R., Kohn M.J., Karavanova I., Kaneko K.J., Vullhorst D., DePamphilis M.L., Buonanno A. Transcription factor TEAD4 specifies the trophectoderm lineage at the beginning of mammalian development // Development. 2007. V. 134. Pp. 3827-3836.

24. Yamanaka Y., Ralston A., Stephenson R.O., Rossant J. Cell and molecular regulation of mouse blastocyst // Developmental dynamics. 2006. V. 235. № 9. Pp. 2301-2314.