Получение дифференцированных рекомбинантных белков β2-микроглобулина человека и β2-микроглобулина мыши для его детектирования в химерных молекулах HLA I класса

Трансгенные гуманизированные животные всё более востребованы для биомедицинских исследований, фармакологических испытаний. Создается всё больше линий трансгенных животных, в т.ч. и с нокаутом собственных генов. Остро необходима доказательная база интеграции трансгена, его экспрессии, определение состояния нокаута собственного гена на молекулярно-генетическом уровне, детекция трансляции целевого белка в разных органах и тканях, доказательство отсутствия синтеза белка (или его нефункциональность), ген которого был модифицирован. Для этого требуются высокоспецифичные реагенты — в частности, белки и антитела к ним, в подавляющем большинстве своём представленные иностранными производителями. Была поставлена задача идентификации β2-микроглобулина мыши и человека в белковых фракциях органов и тканей трансгенных и нокаутных мышей нескольких HLA-линий, созданных в последние годы в НЦБМТ ФМБА России. На первом этапе наших исследований были получены штаммы-продуценты E. coli рекомбинантных β2-микроглобулина мыши mβ2mg и β2-микроглобулина hβ2mg человека. Нуклеотидные последовательности генов были адаптированы для синтеза в бактериальной системе, рекомбинантные белки, mβ2mg и hβ2mg очищены и наработаны в количествах, необходимых для получения аффинных сорбентов и иммунизации животных.

1. Богомолова T.Г., Добровольская О.А., Мировская А.А., Аль-Шехадат Р.И., Федорова Е.А., Духовлинов И.В., Симбирцев А.С. Разработка кандидатной субстанции рекомбинантного белка CRM197. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2016;15(1):93–98.

2. Каркищенко Н.Н., Лазарев В.Н., Манувера В.А., Бобровский П.А., Петрова Н.В., Колоскова Е.М., Глотова Е.С. Принципы создания генно-инженерной конструкции для получения гуманизированных трансгенных мышей, несущих ген HLA-С*07:02:01:01, как прообраз инновационных трансгенно-нокаутных биомоделей. Биомедицина. 2024;20(1):8–20.

3. Каркищенко В.Н., Петрова Н.В., Савченко Е.С., Огнева Н.С., Колоскова Е.М., Максименко С.В., Манувера В.А., Бобровский П.А., Лазарев В.Н. Создание полных гибридных ДНК-конструкций с геном человека HLA-A*02:01:01:01. Биомедицина. 2021;17(1):10–23.

4. Каркищенко Н.Н., Рябых В.П., Каркищенко В.Н., Колоскова Е.М. Создание гуманизированных мышей для фармакотоксикологических исследований (успехи, неудачи и перспективы). Биомедицина. 2014;1(3):4–22.

5. Каркищенко В.Н., Рябых В.П., Каркищенко Н.Н., Дуля М.С., Езерский В.А., Колоскова Е.М., Лазарев В.Н., Максименко С.В., Петрова Н.В., Столярова В.Н., Трубицына Т.П. Молекулярно-генетические аспекты технологии получения трансгенных мышей с интегрированными генами N-ацетилтрансферазы (NAT1 и NAT2) человека. Биомедицина. 2016;1:4–17.

6. Кит О.И., Максимов А.Ю., Протасова Т.П., Гончарова А.С., Кутилин Д.С., Лукбанова Е.А. Гуманизированные мыши: методы получения, модели и использование в экспериментальной онкологии (обзор). Биомедицина. 2019;15(4):67–81.

7. Петрова Н.В., Скрипкина М.М. Особенности организации содержания и выведения трансгенных линий мышей в НЦБМТ ФМБА России. Биомедицина. 2021;17(3E):70–75.

8. Савченко Е.С., Огнева Н.С., Каркищенко Н.Н. Эмбриологические аспекты создания новой гуманизированной трансгенной линии мышей с интегрированным геном человека HLA-A*02:01:01:01. Биомедицина. 2022;18(4):10–23.

9. Baneyx F., Mujacic M. Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nat. Biotechnol. 2004;22:1399–1408.

10. Borenstein S.H., Graham J., Zhang X.L., Chamberlain J.W. CD8+ T cells are necessary for recognition of allelic, but not locus-mismatched or xeno-, HLA class I transplantation antigens. J. Immunol. 2000;165(5):2341–2353. DOI: 10.4049/jimmunol.165.5.2341.

11. Korablev A., Lukyanchikova V., Serova I., Battulin N. On-Target CRISPR/Cas9 Activity Can Cause Undesigned Large Deletion in Mouse Zygotes. Int. J. Mol. Sci. 2020;21:3604. DOI: 10.3390/ijms21103604.

12. Makrides S.C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 1996;60(3):512–538. DOI: 10.1128/mr.60.3.512–538.1996.

13. Masemann D., Ludwig S., Boergeling Y. Advances in Transgenic Mouse Models to Study Infections by Human Pathogenic Viruses. Int. J. Mol. Sci. 2020;21(23):9289. DOI: 10.3390/ijms21239289.

14. Rosano G.L., Ceccarelli E.A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Front Microbiol. 2014;5:172. DOI: 10.3389/fmicb.2014.00172.

15. Studier F.W., Moffatt B.A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 1986;189(1):113–130. DOI: 10.1016/0022-2836(86)90385-2.