В ФГБУН НЦБМТ ФМБА России были созданы несколько гуманизированных трансгенных линий мышей-биомоделей, содержащих интегрированный вариабельный человеческий ген главного комплекса гистосовместимости (МНС): линия HLA-A*02:01, HLA-B*07:02, HLA-C*07:02. Животные получены методом микроинъекций линейного фрагмента генно-инженерной конструкции (ГИК) в мужской пронуклеус зигот с последующим переносом потенциально модифицированных эмбрионов в репродуктивный тракт псевдобеременным самкам-реципиентам. Созданная ГИК кодирует химерную молекулу MHC класса I на поверхности клеток, состоящую из α1-, α2-доменов HLA человека и α3-домена комплекса H-2K мыши, стабилизированную β2-микроглобулином человека, соединённым глицин-сериновым линкером с α1-доменом HLA [1–5]. Данные биомодели могут успешно применяться для решения широкого спектра задач, включая исследования иммунных реакций, инфекционных, аутоиммунных и онкологических заболеваний, а также разработки и тестирования вакцин и исследования в области фармакобезопасности и иммуногенности. В данной статье представлены теоретические данные о генетическом полиморфизме исследуемого гена в человеческом геноме, а также практические данные о созданных нами трансгенных линиях мышей-биомоделей и результаты сравнения аллель-специфичного участка у полученных линий животных. Анализ проводился методом секвенирования по Сэнгеру на матрице кДНК.

Трансгенные гуманизированные животные всё более востребованы для биомедицинских исследований, фармакологических испытаний. Создается всё больше линий трансгенных животных, в т.ч. и с нокаутом собственных генов. Остро необходима доказательная база интеграции трансгена, его экспрессии, определение состояния нокаута собственного гена на молекулярно-генетическом уровне, детекция трансляции целевого белка в разных органах и тканях, доказательство отсутствия синтеза белка (или его нефункциональность), ген которого был модифицирован. Для этого требуются высокоспецифичные реагенты — в частности, белки и антитела к ним, в подавляющем большинстве своём представленные иностранными производителями. Была поставлена задача идентификации β2-микроглобулина мыши и человека в белковых фракциях органов и тканей трансгенных и нокаутных мышей нескольких HLA-линий, созданных в последние годы в НЦБМТ ФМБА России. На первом этапе наших исследований были получены штаммы-продуценты E. coli рекомбинантных β2-микроглобулина мыши mβ2mg и β2-микроглобулина hβ2mg человека. Нуклеотидные последовательности генов были адаптированы для синтеза в бактериальной системе, рекомбинантные белки, mβ2mg и hβ2mg очищены и наработаны в количествах, необходимых для получения аффинных сорбентов и иммунизации животных.

Человеческий лейкоцитарный антиген играет первостепенное значение в формировании иммунного ответа и патогенезе заболеваний различной этиологии, в т.ч. при развитии негативных побочных эффектов на фармакологические препараты. Современные стандарты фармакобезопасности требуют совершенствования существующих тест-систем для проведения качественных доклинических исследований. В НЦБМТ ФМБА России был разработан и создан ряд гуманизированных трансгенных линий мышей, несущих гибридные молекулы HLA I класса на поверхности клеток, которые соответствуют аллельным вариантам человека HLA-A*02:01, HLA-B*07:02 и HLA-C*07:02. В данной статье представлены экспериментальные данные по количественному определению белка β2-микроглобулина человека и результаты определения HLA «сэндвич»-методом ИФА у мышей, несущих разные аллели генов HLA I класса. Полученные данные подтверждают наличие целевых функциональных белков (трансгенность) у гуманизированных трансгенных мышей, что согласуется с данными, полученными нами при определении первичной последовательности трансгена методом секвенирования по Сэнгеру. Кроме того, в работе рассматривается научно-практическая значимость таких биомоделей и область их применения.

Введение трансгена может иметь негативное влияние на функционирование жизненно важных систем организма биомодели. Нами был проведён сравнительный анализ иммунного ответа мышей гуманизированной трансгенной линии HLA-A*02:01 и мышей, нокаутных по гену β2-микроглобулина мыши, полученных в НЦБМТ ФМБА России, в сравнении с мышами дикого типа в ответ на введение антигена — иммуноглобулина лошади. У животных линии HLA-A*02:01 и мышей дикого типа был получен максимальный иммунный ответ, который был достигнут на 30-й день от начала иммунизации. Титры антител у данных групп резко увеличились и стали близки — 1:8000000   и 1:4000000 соответственно — это показывает, что модификация генома у трансгенных гуманизированных мышей линии HLA-A*02:01 не повлияла на функционирование иммунной системы. У  мышей, нокаутных по гену β2-микроглобулина мыши, подобной динамики увеличения титров антител не наблюдалось. На 7-й день титр антител в этой группе увеличился до значения 1:400   и  к  30-му  дню  составил  1:6400.  Слабый  иммунный  ответ  у  мышей  с  нокаутом  по  гену  β2-микроглобулина мыши подтверждает неоспоримо важную роль этого белка в формировании иммунного ответа.

Высокоспецифичные реагенты — белки и антитела к ним — необходимые компоненты систем верификации  эффективности  функционирования  трансгенных/нокаутных  животных  биомоделей. В  частности, идентификация β2-микроглобулина мыши и человека в белковых фракциях органов и тканей трансгенных и нокаутных по гену β2-микроглобулина мышей нескольких HLA-линий, созданных в последние годы в НЦБМТ ФМБА России, является важнейшим этапом их паспортизации. На первом этапе наших исследований были получены штаммы-продуценты E. coli рекомбинантных β2-микроглобулина мыши и человека (mβ2mg и hβ2mg), белки выделены и очищены. На следующем этапе работы получены аффинные сорбенты с иммобилизованными mβ2mg и hβ2mg. Для повышения видовой специфичности сыворотки «кролик-анти-hβ2mg» были истощены против рекомбинантного белка mβ2mg, и, напротив, «кролик-анти-mβ2mg» истощали против рекомбинантного белка hβ2mg. Высокоспецифичные антитела были очищены из истощенных сывороток на аффинных сорбентах. Методами дот- и вестерн-блоттинга на примере истощенных и аффинно-очищенных антител «кролик-анти-hβ2mg» было показано значительное повышение их специфичности относительно hβ2mg.

Системное изучение γ-осцилляций выполнено на крысах с хронически имплантированными электродами в прореальную извилину, соматосенсорную кору, дорзальный гиппокамп и гипоталамус. Регистрация и детекция электрограмм головного мозга (ЭГМ) осуществлялась с помощью оригинального программно-аппаратного модуля. Линейные диаграммы строились с помощью устройства QMS17 в частотной полосе 60–250 Гц и более. Математический анализ, нормализация и нормирование рядов γ-ритмов при действии гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), ацетилхолина (АЦХ) и  инсулина относительно аналогичных фоновых рядов были выполнены двойным дискретно-временным преобразованием Фурье и функцией арктангенса двойного угла, которые позволяют извлечь релевантную информацию из крайне малых (1–2 μV) значений γ-осцилляций. Накопление исследуемых веществ — введением фармакологических средств Аминалон (ГАМК), Галантамин (АЦХ), Инсулин  липосомированный.  Верификация  плазменной  концентрации  исследованных средств осуществлялась методом ВЭЖХ и математическим моделированием. Нормированные ЭГМ (НЭМ) отражали интрацентральные механизмы действия тестируемых средств, характеризующиеся стабильностью картины в состояния покоя животных и при действии Аминалона, Галантамина и Инсулина на пике их плазменной концентрации (по параметрам фармакокинетики). γ-активность головного мозга поддерживается на системном уровне. Блокада γ-осцилляций в лобном полюсе приводит к   их активации в сопряжённых структурах головного мозга: гипоталамусе, ретикулярной формации, хвостатом ядре и др. При действии Аминалона наблюдались тотальные депримирующие эффекты на  всём анализируемом диапазоне в заднем ядре гипоталамуса и прореальной извилине, а  также активирующие эффекты на частотном диапазоне 60–75 Гц в передней супрасильвиевой извилине; при действии Галантамина — частичные депримирующие эффекты в гиппокампе и гипоталамусе на частотах около 60–65, 95–105 и 150 Гц; при действии Инсулина липосомированного — частичные активирующие эффекты в передней супрасильвиевой извилине и в дорзальном гиппокампе на частотном диапазоне 60–85 Гц.

В статье представлены результаты исследований, проведенных на минипигсах в Научном центре биомедицинских технологий за последние 10 лет. Приведены сравнения с наиболее значимыми лабораторными животными, а также показаны перспективы участия минипигсов в различных биомедицинских манипуляциях как альтернатива обезьянам, для использования которых существует ряд ограничений.  

В настоящей работе описывается исследование фармакокинетики нового противовоспалительно- го гексапептида, зарегистрированного под названием «Лейтрагин». Исследование проводилось на мини-пигах светлогорской породы при инфузионном, а также однократном ректальном введении в виде раствора и суппозиториев в равной дозе 10 мг. Наименьшее время для достижения максимальной концентрации продемонстрировал инфузионный способ введения, величина Tmax для которого составила 30 мин. Максимальная концентрация (Сmax) при введении Лейтрагина в форме суппозиториев составила 141,37 нг/г. Данная концентрация достигается за Tmax 90 мин, и далее Лейтрагин определяется в сыворотке крови на протяжении 2,5 ч. Абсолютная биодоступность Лей- трагина для суппозиториев составила 59,6%, в то время как для раствора — 70,03%. Достижение концентрационного максимума при клизменном введении Лейтрагина произошло на 150-й минуте, и далее препарат определялся в сыворотке крови на протяжении 4 ч.